no-img
سیستم همکاری در خرید و فروش فایل نگزاوار

بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش- نگهداری سلولها

help

سوالی دارید؟09369254329

سیستم همکاری در خرید و فروش فایل نگزاوار
بهترین ها از دید دانش آموزان
آشنایی با سیستم خرید،فروش و بازاریابی نِگزاوار

گزارش خرابی لینک
اطلاعات را وارد کنید .

ادامه مطلب

بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش- اساس کروماتوگرافی – فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع – تهیه بافرهای پرفیوژن – استخراج متابولیت از ادرار انسان – روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC – جداسازی سلول های کبد موش – متابولیسم نوسکاپین
zip
اردیبهشت ۱۶, ۱۳۹۶

بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش- اساس کروماتوگرافی – فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع – تهیه بافرهای پرفیوژن – استخراج متابولیت از ادرار انسان – روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC – جداسازی سلول های کبد موش – متابولیسم نوسکاپین


بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش- اساس کروماتوگرافی - فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع - تهیه بافرهای پرفیوژن - استخراج متابولیت از ادرار انسان - روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC - جداسازی سلول های کبد موش - متابولیسم نوسکاپین

پایان نامه رشته دارو سازی در ۹۳ صفحه
[tabgroup][tab title=”چکیده ” icon=”fa-pencil-square-o”]چکیده پایان نامه

اطلاع از مسیرهای متابولیسم دارو نقش مهمی در درک سمیت دارو دارد. این اطلاعات می توانند در طراحی داروهای جدید و روشن کردن مکانیسم سرطان زایی ترکیبات شیمیایی به کار روند. از
این رو یافتن روشی مناسب برای بررسی متابولیسم داروها گام مهمی در جهت رسیدن به دیگر اطلاعات  با ارزش در مورد داروها است. متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان، خرگوش و موش صحرایی بررسی شده است. طبق نتایج به دست آمده از این مطالعات نوسکاپین از دو مسیر o- دمتیلاسیون و شکسته شدن پیوند C1-9 متابولیزه می شود و مکونین به عنوان محصول عمده متابولیسم آن شناخته شده است. در این تحقیق متابولیسم نوسکاپین توسط یک روش ex vivo، سلولهای جدا شده کبدی، مورد بررسی قرار گرفت این روش از چند جنبه دارای اهمیت است: این روش حد واسط مناسبی بین روشهای قبلی مانند آنزیم های حل شده، فراکسیون ارگان جدا شده و مطالعه مستقیم روی حیوان کامل است. این سلولها خصوصیات لازم بافت دست نخورده مانند نفوذپذیری غشا را دارا هستند از این رو در بسیاری از مطالعات بیوشیمیایی به کار می روند.

در این تحقیق سلولهای کبد موش صحرایی طی یک فرآیند دقیق جدا شدند و زنده بودن آنها با آزمایش منع تریپان آبی %۱/۰ و مشاهده میکروسکوپی سلولها تأیید شد. شناسایی استاندارد داروی نوسکاپین و متابولیت اصلی آن، مکونین توسط روش HPLC صورت گرفت. اگر چه استانداردهای نوسکاپین و متابولیت اصلی آن در محلولهای Spike شده مشاهده شدند اما این روش قادر به شناسایی متابولیت ها در عصاره سلولی نبود. به نظر می رسد که افزایش حساسیت روش به مشاهده همزمان نوسکاپین و متابولیت ها کمک کند.

 

اختصارات

– ACEIS: Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors

– BSA: Bovine Serum Albomin

-DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium

– DMSO: Dimethyl sulfoxide

EXP: Exposure

EXT: Extract

FBS: Fetal Bovine Serum

FCS: Fetal Calf Serum

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

MTT: 3- [4, 5- Dimethylthiazol- 2- yl]- 2,5- diphenyl tetrazolium bromide

ml: milliLiter

mM: millimole

: ug: Microgram

: Microlitre

Rt = Retention time

SPE= Solid Phase Extraction

v = volume

w = weight

[/tab][tab title=”فهرست” icon=”fa-pencil “]فهرست مطالب

عنوان                                             صفحه

 

 

چکیده پایان نامه

بخش اول: مقدمه

مقدمه………………………………….

۱-۱- اوپیوییدها………………………….

۱-۱-۱- تاریخچه…………………………..

۱-۱-۲- آلکالوییدهای تریاک…………………

۱-۱-۳- پپتیدهای اوپیویید درون زاد………….

۱-۱-۴- آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف………

۱-۱-۵- مصارف بالینی اوپیوییدها…………….

۱-۲- متابولیسم…………………………..

۱-۲-۱- تاریخچه…………………………..

۱-۲-۲- کلیات متابولیسم……………………

۱-۲-۳- مکان های متابولیسم داروها…………..

۱-۲-۴- عوامل تعیین کننده سرعت تغییر شکل زیستی.

۱-۲-۵- تکنیک های تجربی بررسی متابولیسم……..

۱-۲-۶- کاربرد و اهمیت بررسی متابولیسم………

۱-۳- جداسازی سلولهای کبد………………….

۱-۴- روش های مطالعه شده برای شناسایی و اندازه گیری نوسکاپین و متابولیت هایش…………………………..

۱-۵- کلیاتی درباره کروماتوگرافی و HPLC……..

۱-۵-۱- تاریخچه…………………………..

۱-۵-۲- اساس کروماتوگرافی………………….

۱-۵-۳- فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع

۱-۵-۴- کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا……..

۱-۵-۵- اساس دستگاه HPLC…………………..


عنوان                                             صفحه

 

 

۱-۶- نوسکاپین……………………………

۱-۶-۱- برخی اثرات نوسکاپین………………..

۱-۶-۲- فارماکوکینتیک نوسکاپین……………..

۱-۶-۳- مروری بر روند متابولیسم نوسکاپین…….

بخش دوم: روشها و مواد

۲-۱- اهداف مطالعه………………………..

۲-۲- دستگاه ها و وسایل …………………..

۲-۳- مواد……………………………….

۲-۴- تهیه بافرهای پرفیوژن…………………

۲-۴-۱- محلول Stock بافر هنکس با غلظت ۱۰ برابر..

۲-۴-۲- محلول Stock بافر کربس- هنزلیت با غلظت ۲ برابر

۲-۴-۳- بافر هنکس یک………………………

۲-۴-۴- بافر هنکس دو………………………

۲-۴-۵- بافر کربس آلبومین………………….

۲-۴-۶- بافر کربس- هپس…………………….

۲-۵- تهیه محلول کلاژن و کوت کردن پلیت ۶خانه….

۲-۶- محیط کشت……………………………

۲-۶-۱- مراحل تهیه محیط کشت: (۱:۱) DMEM, F12……

۲-۷- سرم جنین گاو (FBS)……………………

۲-۸- کیت استریل پرفیوژن…………………..

۲-۹- تهیه هپاتوسیت های تازه……………….

۲-۹-۱- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش.

۲-۹-۲- بررسی حیات سلولی و نحوه اثر دادن دارو روی سلولهای جدا شده از کبد موش………………………………………

۲-۹-۳- تهیه نمونه برای انجام آنالیز………..

۲-۱۰- روش سنتز مکونین (۶ و ۷- دی متوکسی فتالید)

۲-۱۱- دلایل انتخاب HPLC……………………

عنوان                                             صفحه

 

 

۲-۱۱-۱- مشخصات دستگاه HPLC………………..

۲-۱۱-۲- انواع روش های HPLC آزمایش شده………

۲-۱۱-۳- روش تهیه بافر ۱۰X استات با ۴ pH=…….

۲-۱۱-۴- روش تهیه بافر فسفات سدیم Mm 25 با ۵/۴ pH=

۲-۱۲- استخراج متابولیت از ادرار انسان………

بخش سوم: نتایج

۳-۱- جداسازی سلولهای کبد………………….

۳-۲- سنتز مکونین…………………………

۳-۳- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)….

بخش چهارم: بحث و نتیجه گیری

۴-۱- جداسازی سلول های کبد موش……………..

۴-۲- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)….

۴-۳- متابولیسم نوسکاپین…………………..

۴-۴- متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان……..

خلاصه انگلیسی……………………………

منابع………………………………….

اختصارات……………………………….

[/tab][/tabgroup]

[tabgroup][tab title=”قسمت هایی از متن (۱)”]

اوپیوییدها

۱-۱-۱- تاریخچه

کلمه اوپیویید برای همه مشتقات طبیعی و نیمه صناعی آلکالوییدی تریاک، داروهای مشابه صناعی و شبه اوپیوییدی که فعالیت آنها با آنتاگونیست اوپیوییدی، نالوکسان مهار می شود و همچنین چندین پپتید درون زاد که با چندین زیر گونه از گیرنده های اوپیویید تعامل می کنند، استفاده می شود.

این مواد سالهاست به عنوان ضددرد، نشاط آور و ضد اسهال

و روم قدیم از گیاه خشخاش استفاده شده است. این گیاه دارای دو محصول اصلی است، دانه های خشخاش که بدون مورفین و دارای روغن قابل مصرف اندو دیگری تریاک که دارای شهرت خطرناک و رعب آور است. دانه های خشخاش بعد از رسیدن دارای هیچ ماده خطرناکی نیستند و قابل خوردن یا مصارف دیگر هستند (۱و۲).

در سال ۱۸۰۳ داروشناس آلمانی سرتورنور (Serturner) با جدا ساختن یک ماده قلیایی فعال خالص از تریاک، فارماکولوژی

(۲و۳).

۱-۱-۲- آلکالوییدهای تریاک

بیش از ۴۰ آلکالویید مختلف از تریاک و عصاره آن به دست آمده است. بعضی از این آلکالوییدها ترکیبات تغییر یافته آلکالوییدهای اصلی که به طور طبیعی در گیاه موجودند، می باشد. آلکالوییدهای اصلی تریاک دو دسته اند:

الف) فنانترن ها: مورفین (%۲۱-%۴)، کدئین (%۵/۲-%۸/۰)، تبائین (%۲-%۵/۰)

ب) بنزیل ایزوکینولین ها: نوسکاپین (%۸-%۴)، پاپاورین (%۵/۲-%۵/۰)، نارسئین (%۲-%۱/۰) (شکل ۱-۱).

تریاک همچنین محتوی ۳ تا ۵ درصد اسیدمکونیک است که به حال آزاد یا ترکیب با مورفین، کدئین یا سایر آلکالوییدها دیده می شود. اسیدمکونیک به صورت منشور کریستالیزه شده در آب و الکل محلول است و با

فقط در تریاک وجود دارد، می توان از این آزمایش جهت تجسس تریاک استفاده نمود (۲).

 

 

شکل ۱- آلکالوییدهای اصلی تریاک (۲و۴)


۱-۱-۳- پپتیدهای اوپیویید درون زاد

آلکالوییدهای اوپیوییدی (مانند مورفین)، بی دردی را از طریق تأثیر بر مناطقی از مغز که دارای پپتیدهایی با ویژگی های فارماکولوژیک شبه اوپیویید هستند، تولید می کنند.

عبارتی که در حال

از: آندروفین ها، داینورفین ها، انکفالین ها. آلکالوییدهای اوپیوییدی از طریق تأثیر بر گیرنده های این پپتیدهای درون زاد اثرات خود را اعمال می کنند.

جدول ۱-۱- گیرنده های اوپیوییدی (۱)

زیر گونه گیرندهاعمالمیل ترکیبی پپتیدهای اوپیویید درون زاد
موبی حسی فوق نخاعی، آرامبخشی، مهار تنفس، کند شدن عبور GI، تغییر آزادسازی هورمون و ناقل عصبی 

دانیورفین ها<انکفالین ها<آندروفین ها

دلتابی حسی نخاعی و فوق نخاعی، تغییر آزادسازی هورمون و ناقل عصبیآندروفین و داینورفین ها<<انکفالین ها
کاپابی حسی فوق نخاعی و نخاعی، آثار سایکوتومیمتیک، کند شدن عبور GIآندروفین و انکفالین ها<< داینورفین ها

 

۱-۱-۴- آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف

  • بی دردی: اوپیوییدها قوی ترین داروهای موجود برای تسکین درد هستند.
    آلگونیست های قوی (یعنی آنهایی که بالاترین میزان تأثیر ضد دردی را دارند) عبارتند از مورفین، متادون، مپردین و فنتانیل. کدئین، هیدروکدون و اکسی کدون آگونیست های ضعیف تا متوسط هستند. پروپوکسی فن یک داروی آگونیست بسیار ضعیف است.
  • آرام بخشی و سرخوشی: این اثرات مرکزی ممکن است در دوزهای پایین که برای حداکثر بی دردی لازمند، رخ دهند. بعضی از بیماران دچار خماری (dysphoria)
    می شوند. در دوزهای بالاتر، این داروها ممکن است سبب تیرگی شعور شده و اثرات تخدیری (narcosis) داشته باشند.
  • تضعیف تنفسی: اعمال اوپیوییدها در مدولا سبب مهار مرکز
  • و افزایش فشار داخل جمجمه شود.
  • اعمال ضدسرفه ای: سرکوب رفلکس سرفه با مکانیسم های ناشناخته، اساس استفاده بالینی اوپیوییدها به عنوان ضدسرفه است.
  • تهوع و استفراغ: تهوع و استفراغ بر اثر فعال شدن مرکز شیمیایی
  • به عنوان عوامل ضد اسهال است.
  • عضلات صاف: اوپیوییدها موجب انقباض عضله صاف مجاری صفراوی می شوند (که می تواند تولید کولیک صفراوی کند)، تونوس اسفنگستر میزراه و مثانه را افزایش دهند، و کاهش در تونوس رحم ایجاد می کنند که ممکن است سبب طولانی شدن زایمان شود.
  • تنگی مردمک (میوزیس): انقباض مردمک اثر مشخصه همه اوپیوییدهاست به جز مپریدین که تأثیر مهار کننده موسکارینی دارد.

۱-۱-۵- مصارف بالینی اوپیوییدها

  • بی دردی: این داروها برای درمان درد نسبتا” متوسط تا شدید به کار می روند. در شرایط حاد، آگونیست های
  • آگونیستی قوی (مثل مورفین) حاصل شود. فنتانیل از راه پوستی برای تأثیر ضددرد استفاده شده است. برای درد با شدت متوسط و در شرایط مزمن آگونیست های متوسط از راه خوراکی تجویز می شوند.
  • سرکوب سرفه: ضددردهای اوپیوییدی از جمله موثرترین داروهای موجود ضدسرفه محسوب می شوند. این اثر با دوزهای کمتر از حد لازم برای ایجاد بی دردی حاصل
    می شود. گیرنده هایی که در اثر ضدسرفه اوپیوییدها دخالت دارند ظاهرا” با گیرنده های
  • سرفه سهیم باشند. روشاول ترین اوپیوییدها در تسکین سرفه، دکسترومتورفان، کدئین، لووپروپوکسی فن و نوسکاپین می باشند. کلیه این داروها (به استثنای کدئین) تا حد زیادی فاقد عوارض جانبی اوپیوییدها می باشند.
  • درمان اسهال: اوپیوییدهای انتخابی ضد اسهال شامل دیفنوکسیلات و لوپرامید هستند. آنها به صورت خوراکی
  • دارد. در این مورد به صورت تزریقی مصرف می شوند.
  • وابستگی اوپیوییدها: متادون در درمان حالات قطع مصرف اوپیویید و در برنامه های نگهدارنده برای معتادین به کار می رود (۱).


۱-۲- متابولیسم

۱-۲-۱- تاریخچه

احتمالا” اولین مشاهده از متابولیسم ترکیبات خارجی توسط گنلین (Gnelin) انجام شده است. وی متوجه شد که احشا حیواناتی که با تلور (Tellurium) مسموم شده اند بوی شبیه به بوی سیر می دهد. در سال ۱۸۵۵ وهلر (Wohler) نشان داد که این بو ناشی از مشتق متیله یعنی دی متیل تلورید می باشد.

اولین مکانیسم کنژوگه شناخته شده، بیوسنتز اسید هیپوریک می باشد که توسط کلر (Keller) در سال ۱۸۴۲ بعد از مباحثات زیاد از پیشتاز اولیه آن که اسید بنزوئیک است گزارش گردید. از آن پس مطالعه متابولیسم ترکیبات خارجی با پیشرفت شیمی آلی رشد کرد و همچنانکه ترکیبات جدیدی سنتز می شوند سمیت و سرنوشت آنها در بدن مورد مطالعه قرار می گیرد. اکسیداسیون بیولوژیک بنزن به فنل و تولوئن به بنزوئیک اسید توسط شولزن و نونین (schultzen , Naunyn) در سال ۱۸۶۷ نشان داده شده است و این امر سپس با نشان دادن وجود کنژوگاسیون اتری سولفات (باومان ۱۸۷۶ Baumann)، کنژوگاسیون گلوکورونید (شمیدبرگ schmiededberg و میر meyer سال ۱۸۷۹) و سنتز اسید مرکاپتوریک (جافه Jaffe و باومان Baumann و پروسه Preuse مستقلا” در سال ۱۸۷۹) تعقیب شد. این راههای مختلف متابولیکی در ابتدا منحصرا” واکنش بیوشیمیایی ترکیبات خارجی تلقی می شد تا اینکه سرانجام در حدود اوایل قرن بیستم اهمیت آنها در کاهش سمیت این ترکیبات مورد قدردانی قرار گرفت.

واکنش های مختلف متابولیک به تدریج یکی بعد از دیگری کشف گردیدند مثلا” تبدیل سیانور به تیوسیانات (لنگ ۱۸۹۴ Lang)، احیای ترکیبات نیتروحلقوی (میر ۱۹۰۵) و کنژوگاسیون اسید فنیل استیک با گلوتامین (Theirfelder and shermin 1914) .

ولی به هر حال شاید مهم ترین این پیشرفت های جدید کشف Brodie و همکارانش بود که آنزیمهایی که بسیاری از تغییرات متابولیک را انجام می دهند در رتیکولوم اندوپلاسمیک (میکروزوم) سلول کبدی نشان دادند. این امر سبب درک عمیق تری از مکانیسم واکنش های غیرسمی شدن گردید و سرانجام منجربه این نتیجه گردید که این واکنش ها روندهای اختصاصی برای حذف ترکیبات خارجی از بدن هستند و ربطی به متابولسیم سوبستراهای معمولی ندارند (۵).

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.[/tab][tab title=”قسمت هایی از متن (۲)”]

کلیات متابولیسم

انسانها روازنه در معرض تعداد گسترده ای از مواد بیگانه هستند که اصطلاحا” xenobiotics نامیده می شوند. موادی که از طریق شش ها یا پوست جذب بدن می شوند یا خیلی عمومی تر به صورت غیرعمدی و به شکل مواد موجود در غذاها یا نوشیدنی ها یا عمدا” به شکل دارو به منظور اهداف درمانی یا تفریح و خوشگذرانی

در صنعت اغلب با رشد و زایش مواد جدید شیمیایی همراه است. رشد و پذیرش صنعت داروسازی استفاده عمومی از داروهای درمانی و سایر xenobiotic ها را عرضه کرده است (۶).

همزمان با تکامل سلولهای یوکاریوت و تکامل تنوع گونه ای و تیره ای ارگانیسم ها مکانیسم هایی برای مقابله با تاخت و تاز مواد شیمیائی گوناگون ذکر شده در پاراگراف بالا به

تمایل دارند که به شکل غیریونیزه و لیپوفیل باقی بمانند و اغلب دارای اتصال بالا به پروتئین های پلاسما هستند. چنین موادی که به آسانی از گلومرول ها فیلتره نمی شوند. از سوی دیگر طبیعت لیپوفیل غشاء توبول های کلیوی جذب مجدد ترکیبات هیدروفوب را تسهیل می کند. بنابراین بسیاری از داروها می بایست طول اثر طولانی می داشتند اگر پایان اثر آنها تنها از طریق دفع کلیوی صورت می گرفت (۱).

ترکیبات xenobiotic

(Biotransformation) ارائه کننده فعالیت بیشتر و یا خصوصیات سمی همچون سمیت سلولی (cytoxicity)، جهش زایی (Mutagenicity)، خاصیت ناقص کننده جنین (Teratogenicity) و سرطان زایی (carcinogenicity) می باشند (۱).

اکثریت سوخت و سازهای متابولیکی در نقطه ای بین جذب دارو به گردش عمومی خون و حذف کلیوی رخ می دهند. در حالت کلی، این واکنش ها را می توان در دو دسته بزرگ تحت نام

قطبی تر تبدیل می کنند. در اغلب موارد، این متابولیت ها غیرفعال هستند ولی مواردی وجود دارد که فعالیت، فقط اندکی تغییر می یابد (۱).

اگر متابولیت فاز اول به اندازه کافی قطبی باشد می تواند

همانند گلوکورونیک اسید، سولفوریک اسید، استیک اسید یا اسید آمینه با گروه عاملی تازه تثبیت شده ترکیب می شود تا کنژوگه ای با قطبیت بالا به وجود آورد (۱).

بسیاری از آنزیم های متابولیزه کننده داروها در غشاهای لیپوفیلی شبکه اندوپلاسمیک کبد و دیگر بافتها واقع شده اند. وقتی که این غشاهای لایه لایه توسط هموژنیزه کردن و جدا کردن بخشهای سلولی از هم، جدا می شوند به شکل وزیکول هایی درمی آیند که میکروزوم نام دارد. میکروزومها بسیاری از خواص ظاهری و عملکردی غشاء دست نخورده را که شامل ویژگی سطح صاف و خشن شبکه اندوپلاسمیک صاف (بدون ریبوزوم) و شبکه اندوپلاسمیک خشن (آراسته به ریبوزوم) است را حفظ می کنند. میکروزومهای صاف پر از آنزیمهای مسئول متابولیسم اکسیداتیو داروها می باشند. به خصوص میکروزومها محتوی آنزیم هایی هستند که به نام اکسیدازهای با عملکرد مختلط یا مونواکسیژناز شناخته می شوند. فعالیت این آنزیم ها نیازمند حضور عامل احیا کننده NADPH و اکسیژن مولکولی است. در حالت کلی یک مولکول اکسیژن به ازاء یک مولکول دارو مصرف (احیاء) می شود، به نحوی که یک اتم اکسیژن در ساختمان محصول و اتم دیگر به شکل آب ظاهر می گردد (۱).

در این روند اکسایش و کاهش، دو آنزیم میکروزومی نقش کلیدی ایفا می کنند. اولین آنزیم، یک فلاوپروتئینی به نام احیاء کننده NADPH-Cytochrome P450 می باشد. دومین آنزیم یک هموپروتئین است که سیتوکروم P450 خوانده می شود. سیتوکروم P450 هموپروتئین داخل سلولی است که اکسیژن مولکولی را فعال می کند و از آن در

قرار می گیرد. اکثر هموپروتئین ها در پستانداران (مانند هموگلوبین، سیتوکروم b  پراکسیداز) دارای نیتروژن از گروه ایمیدازول اسید آمینه هیستیدین می باشند که به عنوان لیگاند مشابه به کار می رود. نقش گروه تیول به عنوان لیگاند تغییر دانسیته الکترون حلقه پور فرین در حال رزونانس هِم است که سبب تأمین مرکز الکترونی جهت فعال سازی اکسیژن مولکولی می شود (۶).

نام سیتوکروم P450 برگرفته از ویژگی طیف نوری این هموپروتئین ها می باشد. و برای بار اول توسط مارتین گلین کن برگ (martin Klingenberg) در سال ۱۹۵۸ میلادی شناسایی شد. وی متوجه شد که یک سری از

ابر خانواده (super family) آنها آورده شده است. به طور دقیق P450 ها ، مونواکسیژناز و یا اکسیژنازهای با عملکرد مختلط هستند.

شکل۱-۲-  طبقه بندی ۴۰ سیتوکروم شناخته شده انسان به صورت خانواده (۸).

در بسیاری از موارد آنزیم های P450 واکنش هایی را برای تبدیل

می دهد. (ب) کمپلکس سوبسترا- P450 فریک با انتقال یک الکترون از NADPH احیاء می شود. (ج) کمپلکس سوبسترا- فروس با اکسیژن مولکولی واکنش
می دهد تا کمپلکس سه گانه اکسیژن- سوبسترا-P450 فروس را تشکیل دهد (د) کمپلکس مذبور به توسط انتقال دومین الکترون از NADPH بیشتر احیاء می شود. در این

شرکت کند (۶و۹). شکل ۱-۴ نشان دهنده چرخه کاتالیتیکی سیتوکروم P450 می‌باشد.

شکل ۱-۳-  معادله واکنش های اکسیداز (اکسیژناز) با عملکرد مختلط وابسته به P450 و دو نوع متفاوت سیستم حامل انتقال دهنده الکترون مرتبط با P450 های مختلف بسته به موقعیت داخل سلولی (۹) .

خصوصیات اکسید کنندگی قدرتمند اکسیژن فعال شده، امکان

بعنوان سوبسترا در این سیستم به کار می روند، حلالیت چربی بالا می باشد.

شکل ۱-۴- چرخه کاتالیتیک P450 توضیح دهنده نقاط کلیدی در چرخه که سوبسترا با آنزیم و اکسیژن فعال شده واکنش می دهد (۱۰).

 

۱-۲-۳- مکان های متابولیسم داروها

مهمترین عضو برای متابولیسم داروها کبد است. کلیه ها نقش مهمی در متابولیسم برخی داروها دارند. تعداد کمی از داروها (مانند استرها)، در بسیاری از بافتها (کبد، خون، دیواره روده و غیره) به علت توزیع وسیع آنزیم هایشان متابولیزه می شوند (۱).

۱-۲-۴- عوامل تعیین کننده سرعت تغییر شکل زیستی

سرعت تغییر شکل زیستی یک دارو در بین افراد مختلف ممکن است تفاوت چشمگیر داشته باشد. این تفاوتها اغلب به علت تفاوت های ژنتیکی یا القاء شده توسط دارو می باشند. در

متابولیسم دارو را در هنگام طراحی برنامه مقدار بندی باید مدنظر داشت. سیگار کشیدن که از علل رایج القای آنزیمها در کبد و ریه می باشد ممکن است متابولیسم برخی داروها (ملنند تئوفیلین) را افزایش دهد (۱).

۱-۲-۵- تکنیک های تجربی بررسی متابولیسم

تعیین سرنوشت ترکیبات خارجی با استفاده از تکنیک های معمولی بیوشیمیایی نظیر خوراندن ترکیبات به حیوانات در حال عادی و یا با کانول در راههای صفراوی، تجربیات کبد پرفیوزه و مطالعات آنزیمی بر روی برشهای بافتی، هموژنه ها (Homogenates) و اجزای سلولی صورت می گیرد. از آنجائی که محصولات متابولیسم سرانجام توسط حیوان دفع
می گردند، روش مستقیم و در عین حال مشکل عبارت است از جدا کردن متابولیتها و
کنژوگه های آنها از مواد دفعی حیوان و تعیین ساختمان شیمیایی آنها. برای آزاد کردن متابولیتها از مشتقات کنژوگه آنها هیدرولیز آنزیمی به هیدرولیز اسید ترجیح دارد، چون روش دوم اختصاصی نبوده و غالبا” منجربه تشکیل مواد ثانویه می گردد برای مثال اسیدهای مرکاپتوریک از اسیدهای پره مرکاپتوریک و فنلها از مشتقات کنژوگه سیکلوهگزا دی ان، دی هیدرو دی اول و
هیدروکربن ها از دی هیدرومونو اول ها تشکیل می گردند.

رقیق کردن و تکنیک اتو رادیوگرافی در مورد رادیو ایزوتوپها تا حدود زیادی سبب تبدیل مطالعه متابولیسم ترکیبات خارجی به یک رشته علمی کمی گردیده است. همچنین این تکنیکها سبب شده اند متابولیتهایی که محصولات متابولیسم معمولی واسطه هستند نیز مشخص گردند و نشان داده اند که تا چه حد ترکیبات خارجی وارد راههای متابولیک معمولی می گردند.

بسیاری از

ترکیبات اکسیده می شوند که احتمال دارد با متابولیتها اشتباه شوند. برای مثال ۱۴C- سیلکوهگزان به طور رادیوشیمیائی دهیدروژنه شده به ۱۴C- بنزن تبدیل
می گردد و همچنین ۱۴C- و یا ۳۶Cl- آلدرین در اثر نگهداری به دیلدرین و سایر مشتقات پلار تبدیل می گردد. با چنین روش حساس خلوص مطلق ترکیب مارکه شده اولیه ضروری است و این امر باید قبل از استفاده مخصوصا” پس از نگهداری طولانی ماده مورد بحث باید محرز گردد.

در تمامی این روشها بیوشیمیایی از تکنیکهای ضروری کروماتوگرافی (جذبی، روی کاغذ، روی لایه نازک و فاز گازی)، طیفی (جذب ماوراء بنفش و مادون قرمز و فلورسانس)، الکتروفورز و … به طور گسترده استفاده شده است و از طیف نگاری رزونانس مغناطیسی هسته و الکترون پارامگنتیک رزونانس در تشخیص واسطه

سهولت جدا کردن و تشخیص آنها شد. (به عنوان مثال متابولیسم استامید فلئورن به N- هیدروکسی- ۱- استامید و فلئورن) مطالعه توالی واکنشهای مختلف متابولیک و فاکتورهایی که آنها را کنترل می کنند و سرعت نسبی راههای گوناگون از طریق مطالعه کینتیکی امکان پذیر است. ولی این بخش از متابولیسم ترکیبات خارجی به طور وسیعی تحت بررسی قرار نگرفته است (۵).

۱-۲-۶- کاربرد و اهمیت بررسی متابولیسم

مطالعه بیوشیمی ترکیبات خارجی به روشن شدن راههای

اکسیداسیون اسیدهای چرب گردید. مطالعه N- متیلاسیون پیریدین و سایر ترکیبات باعث کشف مکانیسم ترانس متیلاسیون گردید و بررسی استیلاسیون اسیدهای حلقوی و سولفونامیدها منجربه روشن شدن نقش مهم کوآنزیم A در متابولیسم شد.

دانستن متابولیسم دارو دارای اهمیت ویژه ای در درک سمیت دارو دارد. از طرف اداره دارو و غذای ایالات متحده آمریکا و مقامات مشابه در دیگر کشورها برای ارزشیابی داروهای جدید بررسی سرنوشت متابولیک داروها

خارجی در طراحی حشره کشهای جدید دارای اهمیت است. روشن شدن مکانیسم سرطان زایی از مطالعه متابولیسم ترکیبات شیمیایی سرطان زا و اخیرا” از تحقیقات القاء

خارجی به طرق مشابهی دانستنی ها را در زمینه ژنتیک انسانی بالا برده است (۵).


۱-۳- جداسازی سلولهای کبد

امروزه سوسپانسیون سلولهای جدا شده کبدی در بسیاری از تحقیقات بیوشیمی شامل متابولیسم داروها (متابولیسم وابسته به سیتوکروم P450) و روندهای مشابه آن مورد استفاده قرار می گیرد. این مدل آزمایشگاهی قبلا” به عنوان ابزار مناسب برای انجام چنین مطالعاتی به اثبات رسیده است (۱۱). این مدل حد واسط مناسبی بین مطالعه به روشهای مختلف از جمله آنزیمهای حل شده، فراکسیون ارگان جدا شده، مطالعه روی حیوان کامل یا کبد پرفیوز شده و جدا شده، است. بنابراین سلولهای کبدی جدا شده، در بهترین حالت به نظر می رسد که خصوصیات لازم بافت دست نخورده شامل ویژگی های نفوذپذیری مشابه را دارا هستند. این ویژگی، مطالعه روی برداشت داروها، تنظیم متابولیسم داروها و تشکیل و دفع متابولیت های دارویی را ممکن کرده است.

تلاشهای اخیر برای جدا کردن سلولهای کبدی از نیروی مکانیکی استفاده کردند و سپس با شلاتورهای  یا K+ پرفیوز کردند ولی این روش برای به دست آوردن مقدار زیادی سلول زنده ناموفق بود. این امر انجام پذیر نیست مگر با جداسازی سلولهای کبد موش صحرایی با استفاده از آنزیم های هضم کننده مثل کلاژناز و هیالورونیداز که توسط هوارد (Howard) و همکارانش معرفی شدند (۱۲). این روش بعدا” توسط Berry و Friend اصلاح شد (۱۳). این دو نفر تکنیک پرفیوژن با گردش مجدد(recirculating perfusion) را پیشنهاد کردند که توسط محققین دیگر بیشتر اصلاح شد. wagle و Ingebresten این مرحله را با به کار بردن آنزیم کلاژناز به عنوان آنزیم منحصربه فرد برای هضم بافت همبند کبد ساده تر کردند (۱۴). علاوه بر این seglen قبل از پرفیوژن با کلاژناز و محلول محتوی  کبد را با عامل خارج کننده  پرفیوز کرد و با این روش توانست زمان پرفیوژن را کاسته، محصول سلولهای زنده را افزایش دهد (۱۵).

اگرچه اکثر تکنیکهایی که امروزه برای جدا کردن هپاتوسیتها به کار می روند دارای مرحله پرفیوژن با آنزیمهای هضم کننده هستند، اما تلاشهای امروزه در جهت اجتناب از مرحله پرفیوژن و ساده تر کردن روش هستند.

امروزه محققان درصدد هستند تا با جدا کردن تکه ای از کبد و قرار دادن آن در محلول حاوی آنزیم به سلولهای جدا شده کبد دست یابند. از آنجائیکه

فرآیند ساده ممکن است هنوز هم در برخی موارد که پرفیوژن ممکن نیست مثل نمونه های بیوپسی کبد مورد استفاده قرار گیرد.

همانطور که در بالا به طور مختصر اشاره شد، سوسپانسیون سلولهای جدا شده کبد امروزه در مطالعات بیوشیمیایی به تناوب استفاده می شود. این ابزار آزمایشگاهی با موفقیت در مطالعاتی که ذکر می شود به کار برده شده است:

مطالعه روی گلوکونئوژنز، گلیکولیز، سنتزپروتئین، لیپید، اسیدهای چرب و اوره، تولید اجسام کتونی، متابولیسم

از بین روشهای متعدد بررسی متابولیسم، جداسازی سلولهای کبدی و قراردادن آنها در محیط کشت انتخاب شده است و این به دلیل مزایایی است که کشت سلول دارد و در ذیل به آنها اشاره می شود.

الف) کنترل محیط

مزایای کشت سلول عبارتند از کنترل فیزیکوشیمیایی محیط کشت سلول شامل pH، حرارت، فشار اسمزی، کشش اکسیژن وانیدریدکربونیک که می تواند به طور بسیار دقیق بررسی گردد و

ناشناخته ای نظیر هورمونها و یا  مواد تنظیم کننده است. با وجود این به تدریج اثرات شناخته شده و در نتیجه توسط ترکیبات مشخصی جایگزین گردیده است.

ب) اقتصاد

در کشت، سلولها می توانند به طور مستقیم در معرض اثر یک معرف با غلظت مشخص یا پائین تر از حد معمول قرار گیرند. در نتیجه در مقایسه با تزریق آن معرف به یک موجود زنده که بیش از ۹۰ درصد آن ماده از طریق دفع و یا پراکندگی در سایر بافتها به هدر می رود مقدار کمتری از آن معرف مورد نیاز است (۱۷).

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.[/tab][tab title=”قسمت هایی از متن (۳)”]

– روش های مطالعه شده برای شناسایی و اندازه گیری نوسکاپین و
متابولیت هایش

نوسکاپین یکی از آلکالوییدهای بنزیل ایزوکینولین موجود در تریاک است. روشهای مختلفی برای شناسایی و اندازه گیری نمونه های غیربیولوژیک اوپیویید وجود دارد که در اینجا گردآوری شده اند. این روشها برای شناسایی و اندازه گیری آلکالوییدهای تریاک که نوسکاپین هم یکی از آنها است مفید هستند این روشها در دو گروه عمده تقسیم بندی شده اند که در ذیل ذکر شده اند:

  1. Chromatographic Techniques
  • TLC
  • HPTLC
  • GLC
  • HPLC
  • GC/MS
  • LC/MS
  • Other Techniques
  • Spectrophotometry
  • Fluorometry
  • Colorimetry

۱۰- Circular Dichroism

۱۱- Crystallography

۱۲- Microcrystal Tests

۱۳- Microdiffusion Analysis

روشهای متعددی برای آنالیز آلکالویید ایزوکینولین در مایعات بیولوژیک مورد استفاده قرار گرفته اند که عبارتند از تکنیکهای فلورومتری، کروماتوگرافی گازی، کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی مایع (۱۸). روشهای متعددی برای انجام کروماتوگرافی مایع به کار رفته است که عبارتند از:

– روش Johansson و همکارانش یک روش فاز نرمال بوده و شناسایی با دتکتور ماورای بنفش در طول موج ۳۱۳

سازی متعددی انجام شود که وقت گیر هستند. از این رو روشهای دیگری مورد استفاده قرار گرفته اند (۱۸).

– روش Jensen که یک روش فاز معکوس بوده و شناسایی با دتکتور ماورای بنفش در طول موج ۲۳۰ نانومتر انجام می شود.

حداقل غلظت قابل اندازه گیری با این روش ۱۰ نانوگرم در میلی لیتر سرم است. این روش به شرایط کروماتوگرافی وابستگی زیادی دارد. زیرا استاندارد داخلی در آن استفاده نشده است (۱۹).

  • روش Haikala که یک روش فاز معکوس بوده و شناسایی با دتکتور ماورای
  • noscapin embonate مناسب است. این روش برای شناسایی نوسکلاپین حساس و سریع و قابل اعتماد است و آماده سازی نمونه آسان است (۱۸).

جزئیات متابولیسک نوسکاپین به خوبی شناخته نشده است اما چند متابولیت مثل نارکوتولین، کوتارنین، هیدروکوتارنین و مکونین شناسایی شده اند. سطوح پلاسمایی نوسکاپین همانطور که ذکر شد توسط کروماتوگرافی مایع فاز نرمال یا فاز معکوس اندازه گیری شده است. متابویتها فقط در ادرار و میکروزومهای کبد موش صحرایی شناسایی شده اند (۱۸).

در سال ۱۹۸۲ Cone و همکارانش استفاده از
methane chemical ionization (CI) mass fragmentography (MF) را برای شناسایی و اندازه گیری آلکالوییدهای تریاک و متابولیت هایش در ادرار انسان بعد از خوردن تریاک توضیح دادند.

در سالهای اخیر استفاده از کروماتوگرافی مایع

و پرکلریک اسید رسوب داده شده بودند. نوسکاپین و متابولیتهای قطبی در پیش ستون به دو دسته جدا شدند و هرفراکسیون برای جداسازی بیشتر به یک ستون آنالیز جداگانه منتقل شد (۴).

 

 


۱-۵- کلیاتی درباره کروماتوگرافی و HPLC

۱-۵-۱- تاریخچه:

آغاز همه انواع کروماتوگرافی کارهای گیاه شناس روسی تسوت (Tesvet) است که در سالهای ۱۹۰۰-۱۸۹۵ به منظور جدا

جذب گردد. سپس اجزای مختلف جذب شده را به ترتیب با حلالهای مناسب از ستون جدا کرد. چون این دانشمند در پی جدا کردن مواد رنگی بود (رنگ = chromos) نام این عملیات را کروماتوگرافی نهاد (۲۰).

۱-۵-۲- اساس کروماتوگرافی

کروماتوگرافی جداسازی اجزای یک مخلوط با استفاده از تفاوت در توزیع تعادلی (k) اجزای مخلوط میان دو فاز متحرک

اجزا می باشد (۲۱).

۱-۵-۳- فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع

فاز ساکن یک ماده جامد یا یک مایع است که به صورت پوشش نازکی روی یک پایه جامد قرار گرفته است. فاز متحرک هم می تواند آب، محلول آبی یک اسید، باز یا نمک، بیشتر حلالهای آلی یا مخلوطی از آنها باشد (۲۲).


۱-۵-۴- کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

احتمالا” مهمترین پیشرفتی که از سال ۱۹۶۶ در کروماتوگرافی

)   نامیده می شود. این روش به اندازه ای متفاوت از روشهای قدیمی است که آن را کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نام
نهاده اند.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در واقع روشی مشابه کروماتوگرافی گازی است که در آن فاز ساکن یک سطح جامد، یک مایع، یک رزین تعویض یونی یا یک پلیمر متخلخل است که درون یک ستون فلزی قرار داد و فاز متحرک مایع با فشار از میان آن می گذرد.

۱-۵-۵- اساس دستگاه HPLC

یک دستگاه HPLC از چهار قسمت عمده تشکیل می گردد:

– پمپ

– سیستم تزریق نمونه

– ستون جداسازی

– ردیاب به همراه یک سیستم پردازش کننده (۲۳).


۱-۶- نوسکاپین

نوسکاپین یا نارکوتین در سال ۱۸۱۷ توسط Robiquet جدا و نامگذاری شد (۲۴). برای مدتهای طولانی هیچ گونه مطالعه بیولوژیکی قابل ملاحظه ای در مورد آن صورت نگرفت. در سال ۱۹۵۴ اثر ضدسرفه آن در حیوانات به اثبات رسید و در سال ۱۹۸۵ این اثر در بیماران با سرفه مزمن هم اثبات

و حالت ‹‹باز›› آن اسید (نوسکاپینیک اسید) است (۲۶).

نوسکاپین به فرم «باز» نوسکاپینیک اسید           نوسکاپین به فرم «بسته» لاکتون

شکل ۱-۵- شکل مولکولی نوسکاپین و نوسکاپینیک اسید (۲۶)

 

فرمول بسته آن به صورت  به نام شیمیایی ‌]- متیل – ۸- متوکسی – ۶و۷- متیلن ادیوکسی – ۱- (۶و۷ دی

که شامل ۹۱/۶۳% کربن، ۶۱/۵% هیدروژن، ۳۹/۳% نیتروژن، ۰۹/۲۷% اکسیژن است (۳و۲۷).

۱-۶-۱- برخی اثرات نوسکاپین

نوسکاپین سبب ایجاد پلی پلوئیدی در لنفوسیتهای انسان می گردد که البته این حالت و تأثیرات سمی که برژن دارد، در دوزی که به عنوان ضد سرفه تجویز می شود تقریبا” بعید است (۲۸).

همچنین نوسکاپین به عنوان یک داروی غیرمخدر و یک ضدسرفه که به صورت مرکزی عمل می کند، سبب ایجاد پلی پلوئیدی در سلولهای CHL همستر چینی می گردد که این اثر در سلولهای سایر جوندگان نیز مشاهده شده است.

به علاوه بررسی های انجام شده نشان می دهد که انقباض ناشی از تحریک الکتریکی استریپ نای خوکچه هندی از یک

پپتیدین در یک مسیر وابسته به غلظت مهار می شود در حالی که اثر مهاری نوسکاپین بر این انقباض ناچیز است (۲۹).

نوسکاپین سبب مهار انقباضات ناشی از برادی کینین در ایلئوم خوکچه هندی و وازودفران موش صحرایی به صورت وابسته به دوز می گردد (۳۰).

همچنین ادم مغزی متعاقب ایسکمی که با واسطه برادی کینین اتفاق می افتد توسط نوسکاپین به طور قابل توجهی کاهش می یابد (۳۱). در تحقیقی دیگر، سرفه ایجاد شده توسط کاپتوپریل در خوکچه هندی به طور قابل توجهی با تجویز نوسکاپین مهار شده است.

با توجه به اینکه

، کاهش سرفه بر اثر تجویز نوسکاپین ناشی از آنتاگونیزه کردن اثر برادی کینین می باشد (۳۲).

نوسکاپین به عنوان یک عامل مداخله کننده میکروتوبولی موجب توقف میتوز می شود. این دارو به صورت استوکیومتری به توبولین متصل شده و سبب ایجاد تغییر در حرکت میکروتوبول می شود و مشاهده شده که دو مشتق نوسکاپین (۵، برومونوسکاپین و ۵، برومونوسکاپین احیا شده) بدون اثر سوء بر پلی مریزاسیون یا دپلی مریزاسیون میکروتوبولها دارای قدرت بیشتری از نوسکاپین در اتصال به توبولین ها هستند (۳۳).

همانطور که اشاره شد نوسکاپین به عنوان یک عامل مداخله کننده توبولینی است، اما در این اثر نه تنها با پاکلی تاکسول رقابت نمی کند بلکه در کارسینوم تخمدان انسانی حساس و مقاوم به پاکلی تاکسول دارای اثرات مهاری بسیار سودمندی در تکثیر سلولی می باشد و این خود سبب شده که از نوسکاپین به عنوان یک عامل ضدسرطان قوی در سرطانهای مقاوم به پاکلی تاکسول بهره جست (۳۴).

با توجه به تمام مباحث فوق، نوسکاپین به توبولین می چسبد و از طریق جلوگیری از تشکیل دوک های میتوزی که یکی از مهمترین مراحل تقسیم می باشد جلوی میتوز را گرفته و به دنبال آن با اپاپتوزیس، سبب مرگ سلولی می گردد. نوسکاپین در مقایسه با سایر

توان از نوسکاپین به عنوان یک داروی مهم و جدید شیمی درمانی سرطانهای انسانی بهره جست (۳۵).

با وجود اینکه نوسکاپین باعث توقف رشد سلولهای تومر می گردد ولی با این دوز هیچگونه سمیتی روی سلولهای نرمال کلیه، قلب، کبد، مغز استخوان، طحال و روده کوچک ندارد از سوی دیگر نوسکاپین خوراکی پاسخ ایمنی

نوان یک عامل ضدسرفه در مهار سرفه های ایجاد شده با ACEIS شناخته شده است (۳۶).

۱-۶-۲- فارماکوکینتیک نوسکاپین

بعد از تجویز خوراکی نوسکاپین (قرص و محلول) به افراد سالم نیمه عمر نوسکاپین (مستقل از شکل فرمولاسیون و مقدار دوز) ۵/۴ ساعت بود. تفاوت چشمگیری بین نیمه عمر حذف بعد از مصرف خوراکی و تزریق داخل وریدی وجود نداشت.

نتایج حاصل از بررسی فارماکوکینتیک داخل وریدی نوسکاپین نشان می دهد کلیرانس پلاسمایی این دارو ۳۲/۱ لیتر در ساعت

متابولیزه می شود، بیانگر بالا بودن عبور کبدی اولیه است. پایین بودن فراهم زیستی بعد از مصرف خوراکی (%۳۰) هم تأیید کننده عبور کبدی اولیه زیاد است.

حجم توزیع ظاهری نوسکاپین ۷/۴ لیتر بر کیلوگرم، نشان دهنده توزیع نسبتا” وسیع آن در بافتهای مختلف به دلیل چربی دوست بودن آن می باشد.

توزیع نوسکاپین بعد از تجویز داخل وریدی تابع مدل کینتیکی دو بخشی است. نوسکاپین تمایل زیادی برای اتصال به آلبومین پلاسما دارد (۲۵و۲۶).

۱-۶-۳- مروری بر روند متابولیسم نوسکاپین

نوسکاپین یک آلکالویید با ساختار۱- فتالید ایزوکینولین است که در کلینیک به عنوان یک عامل ضدسرفه مورد استفاده قرار گرفته است. در تریاک، نوسکاپین به همراه مورفین است و یکی از آلکالوییدهای اصلی می باشد. برای اهداف قانونی و

متعددی روی وضعیت متابولیکی نوسکاپین در انواع پستانداران انجام شده است.

نتیجه مطالعات سال ۱۹۷۶ و ۱۹۷۹ این بود که متابولیسم نوسکاپین در موش صحرایی، خرگوش، انسان، ناشی از O- دمتیله شدن و شکسته شدن پیوند C-C در کربن ۱و۹ برای ایجاد سه نوسکاپین O- دمتیله و مکونین بود (۲۷). مطالعه بیشتر واکنشهای متابولیک در تحقیقات اخیر نشان داد که دارو از طریق شکسته شدن بخش متیلن ادیوکسی (

کینولین به کاتکولهای مشابه نیز تبدیل شوند. علاوه بر متابولیتهای مذکور مطالعات دیگر ترشح دو مکونین دمتیله را تائید کردند. مقادیر متابولیتهای ترشح شده در ادرار گونه های مختلف متفاوت است. در خرگوش متابولیت اصلی مکونین بود که از شکسته شدن پیوند C1-9 به دست آمد. در موش

شکسته شدن C1-9 و O – دمتیلاسیون به خصوص در یک نمونه خانم دیده می شود. هیچ تفاوت خاصی در طبیعت کنژوگه های ۶- دز متیل مکونین، که عبارتند از گلوکورونید (%۶-%۳) و سولفات (%۱۷-%۱۰)، با %۸۰ باقیمانده

روی هردو بخش فتالید و تتراهیدرو ایزوکینولین انجام می شود تا محصول    ۸ و- (یا ) – دی –O- دز متیل نوسکاپین (MB-4) تولید شود.

شکسته شدن حلقه متیلن ادیوکسی در بخش تترا هیدرو ایزوکینولین بخش مهم متابولیسم در خرگوش و انسان است. با این وجود متابولیت (MB-1) در ادرار موش صحرایی جدا نشد. این متابولیت فقط به صورت کنژوگه در ادرار خرگوش

باند c-c گزارش شده است، مثل د آلکیلاسیون ۵,۵-disubstituted barbiturates و داتیلاسیون گلوتتماید که هردو در محدوده کمی روی دادند.

اخیرا” شکسته شدن باند  به عنوان واکنش متابولیکی ۱- بنزیل ایزوکینولین گزارش شده است. در مورد نوسکاپین شکسته شدن باند c-c  همانند دسته کلی فتالیدها مهم است. به ترتیب برای موش صحرایی، خرگوش و انسان درصد شکسته شدن باند c-c %12 ، %۱۱ ، و %۷۵ –۷ می باشد (۳۷).

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.

[/tab][/tabgroup]

[tabgroup][tab title=”قسمت هایی از متن (۴)”]

فرمول شیمیایی

 

 

 

 

شکل ۱-۶- مسیر متابولیسم نوسکاپین (۳۷).
۲-۱-
اهداف مطالعه

دانستن متابولیسم دارو دارای اهمیت ویژه ای در درک سمیت دارو و طراحی داروهای جدید است. همچنین دانستن متابولیسم در طب قانونی حایز اهمیت است چون بسیاری از داروها و سموم به سرعت متابولیزه می شوند و فقط به صورت متابولیت هایشان قابل تشخیص
می باشند. مطالعه

نوسکاپین در این تحقیق بود. متابولیسم نوسکاپین در ادرار، پلاسما و میکروزمهای کبدی بررسی شده است و هدف عمده، راه اندازی روش جداسازی سلولهای کبدی بود. چون این روش حد واسط مناسبی بین روشهایی است که در گذشته مورد

لازم و ضروری یک بافت دست نخورده را دارد و از نظر ویژگیهای نفوذپذیری شباهت زیاد به بافت سالم دارد و در مطالعات بیوشیمیایی متعدد کاربرد دارد.

روش آنالیز نمونه های بدست آمده، HPLC بود. دلیل استفاده از این روش جداسازی بهتر، دقت و حساسیت زیاد و تکرارپذیری آن است.


۲-۲- دستگاهها و وسایل

– دستگاه کروماتوگرافی با کارکرد عالی

پمپ مدل ۶۰۰ ساخت شرکت Waters

آشکارساز ماورای بنفش مدل ۴۸۶ ساخت شرکت Waters

نرم افزار Autochrom 2000

– اسپکترومتر جرمی

– دستگاه فیلتراسیون حلالها به همراه .

– دستگاه تهیه آب دیونیزه Mill Q ساخت شرکت Millipore آمریکا.

– دستگاه Magnetic Stirrer & heater ساخت شرکت Fater Electronics

– پمپ پرفیوژن

– حمام بافت

– بن ماری مدل EFL

– انکوباتور CO2

– Inverted microscope

– یخچال با دمای ۴ درجه سانتیگراد

– یخچال با دمای ۲۰- درجه سانتیگراد

– Laminar air flow hood

– اتوکلاو

– فور (oven)

– ترمومتر.

– صافی فلزی ۲۰۰ میکرون

– سرنگ انسولین

.

– ست جراحی شامل: قیچی، پنس، گیره

– کانول فلزی زنگ نزن با قطر خارجی ۵/۲ میلی متر

– سمپلر ۵۰۰۰ میکرولیتر، ۱۰۰۰ میکرولیتر، ۲۰۰-۲۰ میکرولیتر

۲-۳- مواد

جدول ۲-۱- مواد مورد نیاز برای تهیه سلولهای جدا شده کبد موش

شماره ردیفنام مادهنام کارخانه یا شرکت تهیه کننده
۱اورتانMerck
۲آمپول هپارین ۵۰۰۰ واحدI.P.D.I.C Rasht-IRAN
۳سدیم کلرایدMerck
۴پتاسیم کلرایدMerck
۵منیزیم سولفات با دو مولکول آبMerck
۶منیزیم سولفات با هفت مولکول آبMerck
۷پتاسیم دی هیدروژن فسفاتMerck
۸دی سدیم هیدروژن فسفات با دو مولکول آبMerck
۹کلسیم کلراید با دو مولکول آبMerck
۱۰بی کربنات سدیمMerck
۱۱هپس (HEPES)Boehringer mannheim
۱۲سرم آلبومین گاوی (BSA)Blood research & Fractionation
۱۳اتیلن گلیکول – بیس – (- آمینو – اتیل اتر) – N و N` – تترا استیک اسید (EGTA)Sigma
۱۴کلاژ ناز تیپ IASigma
۱۵انسولین – ترانسفرین – سلنیوم – XGibco
۱۶سرم جنین گوساله (F.B.S)
۱۷دی متیل سولفوکساید (D.M.S.O)Merck
۱۸محیط کشت Dulbecco’s MEM/Nutrient Mix F12 (1:1)Gibco
۱۹پنی سیلین G و نمک پتاسیمCalbiochem
۲۰استرپتومایسین سولفات
۲۱اسید استیک گلاسیالMerck
۲۲کلاژن
۲۳تریپان بلو
۲۴الکل ۹۶
۲۵ساولنشهر دارو
۲۶آب دیونیزه تهیه شده از دستگاه Mill QMillipore

 


جدول ۲-۲- مواد مورد نیاز برای بخش HPLC

شماره ردیفنام مادهنام کارخانه سازنده
۱استونیتریل (gradiant grade)Merck
۲متانول (gradiant grade)Merck
۳پتانسیم دی هیدروژن فسفاتMerck
۴اسید ارتوفسفریک %۸۵Merck
۵دی کلرومتانMerck
۶دی اتیل آمینMerck
۷آمونیوم استاتMerck
۸سدیم کلرایدMerck
۹سدیم دی هیدروژن فسفاتMerck
۱۰سدیم هیدروکساید (سود)Merck
۱۱اسید کلریدریکMerck
۱۲آب دیونیزه تهیه شده از دستگاه Mill QMillipore

 


۲-۴- تهیه بافرهای پرفیوژن

۲-۴-۱- محلول Stock بافر هنکس (Hanks Buffer) با غلظت ده برابر.

مواد زیر به دقت وزن و در بالن ۱۰۰۰ میلی لیتری قرار داده شد و با آب به حجم رسانیده شد. محلول حاصله تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد.

Nacl۰/۸۰ گرم
Kcl۰/۴ گرم
MgSo4.2H2o۰/۲ گرم
Na2Hpo4.2H2o۶/۰ گرم
KH2Po4۶/۰ گرم

 

۲-۴-۲- محلول استوک بافر کربس- هنزلیت (Krebs-Henseleit-Buffer) با غلظت دو برابر

محلولهای زیر با توجه به ترتیب ذکر شده به بطری کهربایی رنگ اضافه شدند و بعد از آن گاز کربوژن (۵%CO2 , 95%O2) به مدت ۱۰ دقیقه از آن عبور داده شد.

آب مقطر۷۸۵ میلی لیتر
۱۶٫۰۹% NaCl۲۰۰ میلی لیتر
۱٫۱۰% KCl۱۵۰ میلی لیتر
۰٫۲۲M KH2PO4۲۵ میلی لیتر
۲٫۷۴% MgSo4.7H2O۵۰ میلی لیتر
۰٫۱۲M CaCl2.2H2O۱۰۰ میلی لیتر

 

محلولی از NaHCO3 (71/9 گرم در لیتر حل شده در آب مقطر) با گاز کربوژن به مدت ۱۰ دقیقه حباب دهی شد و سپس به محلول نمکی فوق اضافه گردید. محلول استوک بافر کربس- هنزلیت تا زمان استفاده در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.

۲-۴-۳- بافر هنکس یک (Hanks I Buffer)

مواد زیر در بشر ۵۰۰ میلی لیتر قرار داده شده و pH محلول حاصله با استفاده از سود ۵ مولار در مقدار ۴/۷ تنظیم شد.

 

NaHCO3۵۲/۰ گرم
HEPES۷۵/۰ گرم
BSA۶۶/۱ گرم
EGTA۵۷ میلی گرم
آب مقطر۲۲۵ میلی گرم
محلول استوک هنکس (Hanks) با غلظت ۱۰ برابر۲۵ میلی گرم

 

۲-۴-۴- بافر هنکس دو (Hanks II)

مواد زیر در بشر ۳۰۰ میلی لیتر قرار داده شد و pH محلول حاصله با استفاده از سود ۵ مولار در مقدار ۴/۷ تنظیم شد.

NaHCO3۵۲/۰ گرم
HEPES۷۵/۰ گرم
CaCl2.2H2O۵/۷۳ گرم
آب مقطر۲۲۵ میلی گرم
محلول استوک هنکس (Hanks) با غلظت ۱۰ برابر۲۵ میلی گرم

 

۲-۴-۵- بافر کربس آلبومین (Kerbs-Albumin)

موارد زیر در بشر ۳۰۰ میلی لیتر قرار داده شد و pH محلول حاصله با استفاده از سود ۵ مولار در مقدار ۴/۷ تنظیم شد.

HEPES۷۵/۰ گرم
BSA۵/۲ گرم
آب مقطر۱۲۵ میلی لیتر
بافر کربس هنزلیت (krebs-Henselit)۱۲۵ میلی لیتر

 

۲-۴-۶- بافرکربس هپس (Krebs-Hepes)

مواد زیر را در بشر ۳۰۰ میلی لیتر قرار داده و pH محلول حاصله با استفاده از سود ۵ مولار در مقدار ۴/۷ تنظیم شد.

HEPES۷۵/۰ گرم
آب مقطر۱۲۵ میلی لیتر
بافر کربس- هنزلیت (kerbs-Henselit) با غلظت دو برابر۱۲۵ میلی لیتر

 

۲-۵- تهیه محلول کلاژن و کوت کردن پلیت ۶ خانه

۵۰ میلی گرم کلاژن در ۱۰۰ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال %۲/۰ حل شد. با .نه ۲ میلی لیتر از محلول فوق ریخته شد تا کوت شود. . ماورای بنفش قرار گرفتند.

پلیتهای آماده و در بسته در یخچال قابل نگهداری هستند.

۲-۶- محیط کشت

محیط های کشت شناخته شده از نظر پیچیدگی ترکیبات بسیار متفاوت هستند. برخی حاوی حداقل مواد لازم برای رشد سلول هستند مثل MEM که حاوی اسید آمینه های اساسی،
ویتامین ها و نمکها هستند.د معدنی تکمیل می‌شوند. غلظت مواد غذایی در محیط F12 کمتر از Dulbecco است که یک محیط کشت مشتق شده از محیط کشت MEM است. Sato, Barnes با مخلوط کردن مقدار مساوی از محیط کشت F12,DMEM محیط کشت جدیدی تهیه کردند که فاقد سرم بود و از قدرت تکثیر سلولی مناسبی برخوردار است (۱۷).

۲-۶-۱- مراحل تهیه محیط کشت :  DMEM, F12 (1:1)

  • ۹۰% حجم آب دیونیزه مورد نیاز در بشر ریخته شد.
  • مقدار مناسب از پودر محیط کشت و پودر بی .
  • pH با NaHCO3 یا HCl 1N در ۳/۷ تنظیم شد.
  • محیط کشت آماده شد با صافی۴۵/۰ صاف شد و استریل شد و بعد از صاف شدن pH کمی افت کرده و در ۲/۷ ثابت می شود.

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.[/tab][tab title=”قسمت هایی از متن (۵)”]

اجزای محیط کشت DMEM/F12 (16)

مقدار (مولار)اجزاء
۵-۱۰۵L-alanine
۴-۱۰۷L-arginine
۵-۱۰۵L-asparagine
۵-۱۰۵L-aspartic acid
۴-۱۰۱L-cysteine
۴-۱۰۱L-cystin
۵-۱۰۵L-glutamic Acid
۳-۱۰۵/۲L-glutamine
۴-۱۰۵/۲Glycine
۴-۱۰۵/۱L-histidine
۴-۱۰۲/۴L-isoleucine
۴-۱۰۵/۴L-Leucine
۴-۱۰۵L-Lysine HCl
۴-۱۰۲/۱L-methionine
۴-۱۰۲/۲L-phenylalanine
۴-۱۰۵/۱L-proline
۴-۱۰۵/۲L-serine
۴-۱۰۵/۴L-threonine
۵-۱۰۴/۴L-tryptophan
۴-۱۰۱/۲L-tyrosine
۴-۱۰۵/۴L-valine
۸-۱۰۵/۱Biotin
۵-۱۰۴/۶Choline chloride
۶-۱۰۶Folic acid
۵-۱۰۷Myo-inositol
۵-۱۰۷/۱Nicotinamide
۶-۱۰۴/۹D-Ca
۵-۱۰۱Pyridoxal HCl
۷-۱۰۵/۱Pytridoxine HCl
۷-۱۰۸/۵Rivoflavin
۶-۱۰۴/۶Thiamin
۲-۱۰۸/۱D-glucose
۳-۱۰۱Sodium pyruvate
۷-۱۰۵/۱Linoleic acid
۷-۱۰۱/۵Lipoic  acid
۵-۱۰۶/۳Phenol  red
۷-۱۰۵Putrescine
۷-۱۰۵Vitamin  B12
۳-۱۰۱/۱CaCl2
۳-۱۰۲/۴KCl
۴-۱۰۴MgSO4
۱-۱۰۲/۱NaCl
۲-۱۰۹/۲NaHCO3
۴-۱۰۵/۴NaH2PO4
۴-۱۰۵Na2HPO4
۹-۱۰۸/۷CuSO4  .  ۵H2O
۷-۱۰۲/۱Fe(NO3)3 . 9H2O
۶-۱۰۵/۱FeSO4 . 7H2O
۶-۱۰۵/۱ZnSO4 . 7H2O
۵-۱۰۵/۱Hypoxanthine
۶-۱۰۵/۱Thymidine

 

۲-۷- سرم جنین گاو Fetal Bovine Serum (FBS)

سرم جنین گاو، با فاکتورهای رشد ضروری و گسترده ای که دارد (جدول ۲-۴ و ۲-۵) یکی از ارکان اصلی در رشد رده های مختلف سلولی است. .ه از آزمونهای مبتنی بر املاح تترازولیوم اثرات سیتوتوکسیک نسبی عوامل ضد سرطان در حضور محیط های کشت حاوی سرم در مقابل محیط های کشت فاقد سرم مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج نشان داده که یکی از مهمترین معایب محیط های حاوی سرم مهار اثر سمیت برون تنی بعضی از عوامل ضدسرطان است البته از آنجایی که اثر سمیت سلولی برون تنی اکثر . در هردو نوع محیط حاوی و یا عاری از سرم از سرعت تکثیر یکسانی برخوردارند (۳۸).

در این آزمایشها به علت نیاز سلولها از محیط های سرم دار استفاده شد. براین اساس FBS (خریداری شده از Gibco) قبل از افزودن به محیط کشت سلولها، به مدت نیم ساعت در دمای oC56 .- نگهداری گردید و در زمان کشت به میزان ۱۰% به محیط اضافه می شد.

تذکر: منبع تهیه FBS (یا FCS) متفاوت بوده و معمولا” بسته به سازگاری رده های سلولی انتخاب می شود.


جدول۲-۴- اجزا اصلی سرم (FCS) (39).

غلظت میانگین در یک لیتر

اجزا
۱۳۷ meqNa+
۱۱ meqK+
۱۰۳ meqCL
g to ngFe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Vo3-,
Mo7O246-
۲۶
۱۳۶mgCa2+
۱۰۰mgInorganic Phosphorous
۱۲۵۰mgGlucose
۱۶۰mgNitrogen (urea)
۳۸gTotal protein
۲۳gAlbumin
۳g-۲-Macroglobulin
۳۵mgFibronectin
۲۹mgUric acid
۳۱mgCreatinine
۱۱۳mgHaemoglobin
۴mgBilirubin (total)
۲۵۵UAlkaline phosphatase
۸۶۰ULactate dehydrogenase
۰٫۴  g
۱٫۲  gInsulin
۹٫۵  gTSH(thyroid stim. Hormone)
۳۹  gFSH(follicle stim. Hormone)
۱۷  gBovine growth hormone
۱٫۲  gProlactin
T3(triidothyronine)
۳۱۰  gCholesterol
۰٫۵  gCortisone
۰٫۴  gTestosterone
۸۰ gProgesterone
۶ mgProstaglandin E
۱۲ mgProstaglandin F
۹۰ mgVitamin A
۱ mgVitamin E
۰٫۳۵ mgEndotoxin

 


جدول ۲-۵- سایر اجزای ضروری سرم برای حیات و رشد سلولی در محیط خارج از بدن (۳۹).

Protein
Fibronectin
Fetuim
Transferin
Growth Factors
Insulin-like growth factors I and II (IGF)
Somatomedin A and C
Multiplication stimulating activity
Platelet-derived growth factor 9 (PDGF)
Epidermal growth factor (EGF)
Fibroblast growth factor (FGF)
Enothelial cell growth factor (ECGF)
Amines
Amino acids
Polyamines (spermine, spermidine)
Peptide
Glutathione
Lipids
Linoleic acid
Phospholipids

 

۲-۸- کیت استریل پرفیوژن

کیت پرفیوژن بایستی بعد از شستشوی کامل با آب و ساولن یک شب کامل با آب مقطر آبکشی شود. بسته وسایل برای اتوکلاو عبارتند از :

ست صافی برای استریل کردن محلولهای پرفیوژن

ست جراحی .

بشر ml200 سه عدد، ml300 یک عدد

پلیت یک عدد.

۲-۹- تهیه هپاتوسیتهای تازه

موشهای سفید صحرایی نر Sprague Dawley (190-200 گرم) با تزریق داخلی صفاقی ۶/۰ سی سی محلول اورتان (%۲۵ وزنی – حجمی) به ازاء هر۱۰۰ گرم وزن بدن بیهوش شدند.

حفره صفاقی با ایجاد دو برش متقاطع باز شد و ۱/۰ میلی گرم هپارین (۱۰۰۰ واحد) داخل ورید اجوف تحتانی تزریق شد.

ورید باب با یک قیچی نو قوس دار سوراخ گردید و توسط یک کانول از جنس فولاد زنگ نزن با قطر خارجی ۵/۲ میلی متر کانوله شد.

کانول با استفاده از یک گیره به ورید باب محکم شد و سپس کبد از بقیه اندام ها با دقت جدا گردید.

کبد بدون . کلسیم و حاوی ۶/۰ میلی مول EGTA) پرفیوز شد.

سپس کبد با بافر HANKS II (100 میلی لیتر، حاوی ۲ میلی مول یون کلسیم و %۰۴/۰ وزنی حجمی کلاژنار نوع یک) پرفیوز شد.

سلولهای کبدی با استفاده از پنس در داخل بافر کربس- آلبومین حاوی %۱ وزنی- حجمی آلبومین سرم گاو BSA پخش شدند.

.وبار با ۵۰ میلی لیتر بافر کربس- هپس (kreps-Hepes) شسته شدند و اجازه داده شد تا در اثر نیروی جاذبه ساکن شوند سپس بافر اضافی آسپیره شد.

سلولها در محفظه هماتوسیتومتر شمارش شدند و درصد زیستایی (viability) با روش منع تریپان آبی %۱/۰ (Trypan blue 0.1%) تعیین گردید. با این روش %۹۰ سلولها زنده بودند و رنگ را از خود دفع کردند.

در طول مدت پرفیوژن همه محلولها با گاز کربوژن (۵% CO2 / 95% O2) حباب دهی شدند و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگه . دراتوکلاو استریل شدند.

۲-۹-۱- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش

سلولهای جدا شده از کبد موش در محیط کشت حاوی %۱۰ سرم جنین گاو غیرفعال شده (FBS) و پنی سیلین (۶۰ میلی گرم برای . DMEM , F12 بود. سلولها به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور CO2 قرار داده شدند. سوسپانسیون سلولی حاوی ۶۰۰۰۰ سلول در هرمیلی لیتر بود و در هرخانه از پلیت ۶ خانه ۲ سی سی از سوسپانسیون فوق ریخته شد.

۲-۹-۲- بررسی حیات سلولی و نحوه اثر دادن دارو روی سلولهای جدا شده از کبد موش

آزمون های بسیاری برای اندازه گیری . از آزمون دفع رنگ به سرعت امکان پذیر است به همین دلیل در این رساله از آن استفاده شده است.

بعد از ۲۴ ساعت سلولها از انکوباتور خارج شده زنده بودن آنها باترپیان آبی چک شد بعد از اطمینان از زنده بودن . کنترل فاقد دارو است. مقدار ۵ میلی لیتر نوسکاپین (۰۱/۰ مولار محلول در DMSO) با ۴۵ میلی لیتر محیط کشت (حاوی %۱۰ BSA) مخلوط شده در هرخانه از پلیت ۲ سی سی از این محلول . سانتیگراد منجمد شدند.

۲-۹-۳- تهیه نمونه برای انجام آنالیز

بعد از خارج کردن نمونه ها از فریزر با استفاده از پرکلریک اسید (%۶ حجمی- حجمی ، ۲۰ میکرولیتر به ازای هرمیلی لیتر سوسپانسیون سلولی) پروتئین رسوب داده شد و سپس با سرعت g1500 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ شدند. مایع رویی با ۲ میلی لیتر از بافر فسفات ۴/۷= pH مخلوط شد بعد روی کارتریج های استخراج فاز جامد (. و ۲ میلی لیتر آب دیونیزه شسته شد. ۱۰ دقیقه هوا از ستون عبور داده شد تا خشک شود، بعد با ۵/۱ میلی لیتر استونیتریل مخصوص HPLC نمونه استخراج و در یک . HPLC تزریق شد.

کارتریج های استخراج فاز جامد (SPE) قبلا” با ۲ میلی لیتر متانول، ۲ میلی لیتر آب دیونیزه و ۱ میلی لیتر بافر سدیم فسفات ۴/۷ = pH (50 mM) فعال و آماده شده بودند
(۴۰).

راه دیگری که برای تهیه نمونه انجام شد چنین بود: به اندازه حجم نمونه استونیتریل به آن اضافه شده سانتریفوژ با دور g1500 به مدت ۱۰ دقیقه انجام شد. مایع رویی به HPLC تزریق شد.

۲-۱۰- روش سنتز مکونین (۶و۷- دی متوکسی فتالید)

O- وراتریک اسید (۲و۳- دی متوکسی بنزوییک اسید، ۱۵ گرم، ۱/۰ مول) با فرمالدهید %۳۷ (۴۵ میلی لیتر) رفلاکس شد و با HCl (60 میلی لیتر) به مدت ۳۰ دقیقه تغلیظ شد. بعد از صاف کردن محلول داغ، این محلول تا دمای اتاق سر . مجدد با آب گرم محصول نهایی را ایجاد کرد که کریستالهای بی رنگ بودند (۴۱).

شکل۲-۱- مسیر سنتز مکونین

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.

[/tab][tab title=”قسمت هایی از متن (۶)”]

دلایل انتخاب HPLC

ویژگی های خاص روش HPLC ، این روش را برای آنالیز و بررسی داروها و مواد شیمیایی در مایعات بیولوژیک و سایر محیط ها مناسب کرده است. در ذیل به چند مورد از آنها اشاره می شود:

– امکان به کاربری ستون HPLC به دفعات بدون نیاز به احیای آن

– جداسازی بهتر نسبت به روشهای قدیمی

– دقت و حساسیت زیاد روش

– وابستگی کمتر به مهارت کاربر و بهبود تکرار پذیری به میزان زیاد

– قابلیت اتوماسیون و اندازه گیری در سیستم دستگاهی HPLC

– کوتاه بودن زمان آنالیز

HPLC به دو روش فاز نرمال و فاز معکوس انجام پذیر است. روش فاز معکوس به دلیل مزایایی که دارد انتخاب شده است:

– این .اده انتخابی از آنها را می دهد.

– این روش را می توان در مورد جداسازی ترکیبات یونی یا یونیزه شونده با استفاده از روش زوج یون به کار برد.

– این شیوه از لحاظ عملی آسان تر، سریع تر و تکرارپذیرتر از سایر شیوه های HPLC می باشد.

زمان بازداری مواد مورد آزمایش در جداسازی به روش فاز معکوس توسط چندین عامل تحت تاثیر قرار می گیرد که مهمترین آنها شامل قطبیت فاز ساکن، قطبیت فاز متحرک و pH فاز متحرک است. مواد مورد آزمایش عموما” به ترتیب قطبیت شسته می شوند و قطبی ترین آنها قبل از همه خارج .ی خواهند کرد. نحوه توزیع را می توان با تغییر قطبیت فاز متحرک عوض کرد. یعنی با کاهش قطبیت فاز متحرک توزیع مواد به طرف این فاز افزایش یافته و زمان بازداری آنها کاهش می یابد.

همچنین می توان زمان بازداری را با تغییر قطبیت فاز ساکن (که تابع نوع گروه غیر قطبی این فاز و درصد کربن آن می باشد) و فار متحرک تغییر داد (۲۱).

۲-۱۱-۱- مشخصات دستگاه HPLC

پمپ مدل ۶۰۰ ساخت شرکت Waters

آشکارساز ماورای بنفش مدل ۴۸۶ ساخت شرکت Waters

نرم افزار Autochrom 2000

تعیین مقدار در درجه حرارت آزمایشگاه و توسط ستون C18 با ابعاد mm6/4*mm30 و قطر ذرات ۵ (ساخت شرکت Hichrom) انجام گرفت. .مپ خلاء و صافی ۲۲/۰ میکرون، صاف می شد. محلول توسط گاز هلیم عاری از گاز می شد. تعیین مقدار توسط آشکارساز ماورای بنفش انجام می شد.

هرروز ابتدا ستون کروماتوگرافی توسط متانول خالص به مدت ۳۰ دقیقه و آب ۴۵ دقیقه شستشو داده می شد. سرعت عبور یک میلی لیتر در دقیقه در نظر گرفته شد. بعد از اتمام کار مجددا” ستون یک ساعت با آب و ۳۰ دقیقه با متانول خالص شستشو داده می شد.

۲-۱۱-۲- انواع روشهای HPLC آزمایش شده

روش A از فاز متحرک شامل %۴۵ استونیتریل، %۵۵ پتاسیم دی هیدروژن فسفات (%۶/۰) که pH آن توسط اسید فسفریک غلیظ در ۳ تنظیم شده بود، استفاده شد. فاز متحرک با سرعت ۹/۰ میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و مواد خارج شده از ستون در طول موج ۲۵۴ نانومتر ردیابی شدند.

نوسکاپین و پاپاورین با غلظت های ۱۰۰ و ۱۰ هرکدام به طور جداگانه و به مقدار ۵۰ تزریق شدند (۱۹).

روش B از فاز متحرک شامل دی کلرومتان – متانول – محلول آبی دی اتیل آمین %۲۵/۰ (۲۰:۶۰:۲۰) استفاده شد. فاز متحرک با سرعت یک میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و .ر ۵۰ تزریق شد (۴۲).

روش c از فاز متحرک شامل آب و استونیتریل (۹۸:۲)، mM5 آمونیوم استات استفاده شد فاز متحرک با سرعت ۸/۰ میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و مواد خارج شده از ستون در طول موج ۲۱۰ . ۱۰۰ و ۱۰ به مقدار ۵۰ تزریق شد. با این روش طول موجهای دیگری مورد آزمون قرار گرفتند که عبارتند از:

(۱۸) nm 220 =

(۴۵) nm 280 =

(۱۹) nm 254 =

nm 264 =

(۴۴) nm 310 =

روش D از فاز متحرک شامل %۲۵ استونیتریل و %۷۵ PBS که pH آن حدود ۵/۷ بود، استفاده شد. فاز متحرک با سرعت ۸/۰ میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و مواد خارج شده از ستون با سه طول موج ردیابی شدند. طول موجها عبارتند از:

nm 248 =

nm 264 =

nm 302 =

نوسکاپین با غلظتهای ۱۰۰ و ۱۰ به مقدار ۵۰ تزریق شد.

روش E از فاز متحرک شامل استونیتریل و بافر سدیم فسفات mM25 با ۵/۴ = pH (40:60) استفاده شد. فاز متحرک با سرعت یک میلی لیتر در .ل موج ۲۱۱ نانومتر ردیابی شدند. نوسکاپین و کدئین با غلظت های ۱۰۰ و ۱۰ هرکدام به طور جداگانه و به مقدار ۵۰ تزریق شدند (۴۰).

برای بهبود روش تغییراتی در فاز متحرک داده شد:

E1 کاهش حجم تزریق:

حجم تزریق به ۳۰ و ۲۰ کاهش یافت.

E2 رقیق کردن نمونه تزریقی با فاز متحرک:

کلیه نمونه ها در فاز متحرک رقیق شده به دستگاه تزریق شدند.

E3 افزایش درصد استونیتریل:

درصد استونیتریل کم کم افزایش یافت تا زمان بازداری نمونه (Rt) کاهش یابد.

روش F – از فاز متحرک شامل مخلوط استونیتریل و محلول آب و استیک . جریان یافت و مواد خارج شده از ستون در طول موج ۲۱۱ نانومتر ردیابی شدند. نوسکاپین با غلظت های   ۱۰۰ و  ۱۰ در فاز متحرک رقیق شده به مقدار ۳۰ تزریق شد.

روش G از فاز متحرک شامل مخلوط استونیتریل و محلول آب و استیک اسید (۱۵۰ استیک اسید در ml100 آب) با نسبتهای زیر استفاده شد.

            استونیتریل          :محلول آب و استیک اسید
۹۰۱۰
۸۰۲۰
۷۰۳۰

فاز متحرک با سرعت یک میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و مواد خارج شده از ستون با طول موج ۲۱۱ نانومتر ردیابی شدند. نوسکاپین با غلظتهای ۱۰۰ و ۱۰ تزریق شد.

روش H از فاز متحرک شامل استونیتریل، آب و بافر X10 شامل استات سدیم mM500 و پرکلریک اسید mM100 (4=pH) با نسبتهای زیر استفاده شد.

استونیتریل :    آب :بافرX10
۸۰۱۰۱۰
۷۰۲۰۱۰
۶۰۳۰۱۰
۵۵۳۵۱۰

 

فاز متحرک با سرعت یک میلی لیتر در دقیقه جریان یافت و مواد خارج شده از ستون با طول موج ۲۱۱ نانومتر ردیابی شدند. نوسکاپین، کدئین، مکونین و پاپاورین با غلظتهای مختلف و هرکدام به مقدار ۵۰ تزریق شدند.

۲-۱۱-۳- روش تهیه بافر X10 شامل استات سدیم mM500 و پرکلریک اسید mM100 با ۴= pH

۲۸/۳۱ میلی لیتر استیک اسید (%۹۶) و ۳۵/۱۴ میلی لیتر پرکلریک اسید (%۷۲-۷۰) در یک بالن ۱۰۰۰ میلی لیتری با آب دیونیزه به حجم رسانده شد. با سود N10، pH روی ۴ تنظیم شد. این بافر در فاز متحرک ۱۰ بار رقیق می شود. غلظت استات سدیم به ۵۰ میلی مول و پرکلریک اسید به ۱۰ میلی مول می رسد.

۲-۱۱-۴- روش تهیه بافر فسفات سدیم mM25 با ۵/۴ = pH

۹/۳ گرم از سدیم دی هیدروژن فسفات در یک بالن یک لیتری با آب دیونیزه حل شد و به حجم یک لیتر رسانده شد. pH محلول توسط اسیدفسفریک غلیظ در ۵/۴ تنظیم شد.

۲-۱۲- استخراج متابولیت از ادرار انسان

نمونه ادرار از سه نفر (مرد زیر ۴۰ سال) جمع آوری شد و جداگانه بررسی شد. ۱۰ میلی لیتر شربت Capval® حاوی ۵۰ میلی گرم .ستخراج نمونه با سه میلی لیتر متانول انجام شد محصول استخراج شده زیر نیتروژن خشک شد. ۱۰۰ میکرولیتر از فاز متحرک شامل استونیتریل، آب، بافر X10 (10:35:55) به نمونه اضافه شد و طبق روش H در بخش HPLC آنالیز انجام شد (۴۵).


۳-۱- جداسازی سلولهای کبد

برای پی بردن به مسیر متابولیکی یک دارو با روش سلولهای جدا شده کبدی انتخاب حیوان مورد آزمایش حایز اهمیت است. حیوان باید . بودن کبد و کم بودن تعداد سلول های کبدی، موش صحرایی جایگزین موش سوری شد.

سلول ها با روشی که قبلاً توضیح داده شد جدا شدند و با لام هماسیتومتر شمرده شدند. درصد زیستایی (Viability) آنها با روش منع تریپان آبی%۱/۰ تعیین گردید با این روش % ۹۰ درصد سلول ها زنده بودند و رنگ را از خود دفع کردند.

تصویر سلولهای جدا شده در شکل ۳-۱ آورده شده است. سلولها به شکل چند وجهی با اشکال مختلف هستند. اغلب سلولها به کف پلیت ۶ خانه چسبیده بودند.

۳-۲- سنتز مکونین

نقطه ذوب ماده سنتز شده ۱۰۲ درجه سانتیگراد بود که در محدوده گزارش شده (۱۰۳-۱۰۲ .

به دلیل تطبیق نتایج بدست آمده از تعیین نقطه ذوب و ۱HNMR برای نمونه سنتز شده با نمونه استاندارد سنتز شده توسط Dong-Ung Lee در سال ۲۰۰۲، ماده سنتز شده به عنوان مکونین مورد قبول قرار گرفت (۴۱).


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



۳-۳- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)

از روشهای A و B و C و D و F پیک بدست نیامد. از روش E پیک بدست آمد اما پیکها پهن بوده متقارن نبودند. برای بهبود آشکارسازی روش E تغییراتی در آن ایجاد شد ) اما نتیجه در حد مطلوب نبود.

فاز متحرک G توانست نوسکاپین را از ستون خارج کند اما پیک مناسب نداشت، پیک بسیار پهن بود.

نتایج حاصل از روش H با ترکیب %۶۰-%۱۰-%۳۰ از فاز متحرک برای نوسکاپین، مکونین، کدئین، پاپاورین به ترتیب در شکلهای ۳-۳ و ۳-۴ و ۳-۵ و ۳-۶ آورده شده است.

نتایج بدست آمده از ترکیب %۵۵-%۱۰-%۳۵ از فاز متحرک H برای سه ماده نوسکاپین، مکونین و پاپاورین (استاندارد داخلی) در شکل ۳-۷ و ۳-۸ آورده شده است.

منحنی استاندارد . در لیتر رابطه خطی وجود دارد و منحنی استاندارد از رگرسیون خوبی برخوردار است.

در مطالعه نمونه استخراج شده از عصاره سلولی حاوی نوسکاپین پیک نوسکاپین مشاهده شد به نظر می رسد که غلظت نوسکاپین در عصاره با گذشت زمان همچنان قابل توجه است. در کروماتوگرام بدست آمده از عصاره در زمان های .مان ۰، ۳۰ و ۱۲۰ دقیقه در مقایسه با عصاره کنترل (بدون دارو) در شکل ۳-۱۰ آورده شده است.

در مطالعه ادرار داوطلب مصرف کننده ی دارو  پیک نوسکاپین و متابولیت بدست نیامد. برای اطمینان نوسکاپین و مکونین هرکدام با غلظت ۱۰ میکروگرم در میلی لیتر در ادرار Spike شدند و سپس در HPLC تزریق شدند پیک مربوط به هر کدام از آنها در زمان بازداری خاص آنها مشاهده شد.

متن کامل در نسخه قابل خرید موجود است.[/tab][/tabgroup]

[tabgroup][tab title=”نتیجه گیری ” icon=”fa-pencil-square-o”]– بحث و نتیجه گیری

۴-۱- جداسازی سلولهای کبد موش

اطلاع از متابولیسم داروها دارای اهمیت زیادی است و روشهای in vivo و in vitro متعددی برای مطالعه متابولیسم وجود دارند که در بخش ۱-۲-۵ به آنها اشاره شد. به دلیل مشکلات موجود در روش in vivo، در .. این روش حد واسط مناسبی بین روشهای گذشته (روش مطالعه با محلول جدا شده آنزیمها یا مطالعه روی فراکسیون بافتی جدا شده یا مطالعه روی حیوان زنده) است و ویژگیهای لازم یک بافت دست نخورده را دارد و از نظر ویژگیهای نفوذپذیری شباهت زیادی به بافت سالم دارد (۵و۱۲).

در روش انتخاب شده، زنده نگه داشتن سلولهای جدا شده از اهمیت ویژه ای برخورداراست. در ابتدا فقط از محیط کشت DMEM/F12 استفاده شد که بازدهی کمی داشت. سپس با افزودن انسولین – ترانسفرین – سلنیوم – X (100 میکرولیتر برای ۵۰ میلی لیتر) چسبندگی سلولها به کف پلیت ۶ .نند. تصویر به دست آمده از سلولها حاکی از زنده بودن سلولها
می باشد. سلولها به شکل چند وجهی مشخص بودند (شکل ۳-۱)

علت انتخاب دوز نوسکاپین (۰۰۱/۰ مولار)، به دست آوردن مقادیر بیشتری از متابولیت ها بود از طرفی طبق مقالات گزارش شده، نوسکاپین با دوزی که برای سلولهای تومر بازدارنده است برای . بودن سلولها بعد از اثر دادن دارو با تریپان آبی %۱/۰ موید زنده بودن مقدار قابل توجهی از سلول های کبد ایزوله شده ی موش صحرایی بود.

۴-۲- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)

برای پیاده کردن یک روش تشخیص و شناسایی برای نوسکاپین و متابولیت آن مکونین، در عصاره سلولی با توجه به ساختمان شیمیایی این ترکیب و با مطالعه روشهای HPLC بکار برده شده برای نوسکاپین و سایر آلکالوییدهای تریاک، سیستم کروماتوگرافی با استفاده از ستون فاز معکوس C18 انتخاب شد. روش های مختلفی در این سیستم .. از بین ترکیبات مختلف، مخلوط بافر فسفات و استونیتریل (روش E) قادر به جداسازی نوسکاپین بود اما پیکهای حاصل تیزی و تقارن مطلوب را نداشتند. بافر فسفات برای جداسازی نوسکاپین مناسب نبود و در شرایط روش E احتمالا” نوسکاپین به دو شکل بود (یونیزه و غیریونیزه) و این عامل باعث پهن شدن پیکها می شد.

استفاده از بافر استات برای جداسازی نوسکاپین مناسب تر است و پیچیدگی کمتری نسبت به بافر فسفات دارد. از اینرو در روش . به یونهای ایجاد شده متصل می شود و به عنوان عامل Ion-pair عمل می کند و تمام مولکولهای نوسکاپین در حالت یونیزه باقی می مانند این عمل سبب ایجاد پیکهای تیز می شود. از بین نسبتهای مختلف در روش H نسبت %۵۵-%۳۵-%۱۰ از استونیتریل – آب – بافر با سرعت یک میلی لیتر در دقیقه به عنوان ترکیب نهایی انتخاب شد.

برای انتخاب استاندارد داخلی مناسب، با توجه به این مسأله که استاندارد داخلی باید یک سری خواص فیزیکوشیمیایی شبیه به ماده تحت مطالعه را داشته باشد، لذا آلکالوییدهای تریاک مثل کدئین و پاپاورین به عنوان داوطلبی برای استاندارد داخلی مورد مطالعه قرار گرفتند. با فاز متحرک انتخاب شد. زمان بازدارنده برای کدئین ۸۸/۴ دقیقه و پاپاورین ۵۷/۶ دقیقه بود. زمان بازدارنده کدئین به مکونین (۰۲/۴ = Rt) نزدیک بود و در بخش ابتدایی کروماتوگرام قرار داشت اما نوسکاپین دیرتر خارج می شد و با مکونین فاصله داشت از این رو پاپاورین به عنوان استاندارد داخلی انتخاب شد.

بهترین طول موج ردیابی با توجه به طول موجهای آزمایش شده و نتایج بدست آمده از مقالات ۲۱۱ نانومتر انتخاب شد (۴۰).

زمان بازداری برای نوسکاپین و مکونین به ترتیب ۷ و ۰۲/۴ دقیقه بود که با توجه به ساختمان شیمیایی این دو ترکیب پیش بینی می شود که در یک سیستم کروماتوگرافی . نمونه از عصاره سلولی بکار برده شد. روش اول استخراج فاز جامد با استفاده از فاز جامد C18 بود که بعد از تزریق نمونه نهایی به HPLC پیک متابولیت مکونین بدست نیامد ولی پیک نوسکاپین وجود داشت. با در نظر . مایع رویی به HPLC تزریق شد. در این روش نیز پیک متابولیت مشاهده نشد ولی پیک نوسکاپین وجود داشت.

۴-۳- متابولیسم نوسکاپین

نتیجه مطالعات سالهای ۱۹۷۶ و ۱۹۷۹ این بود که متابولیسم نوسکاپین در موش . که دارو از طریق شکسته شدن بخش متیلن ادیوکسی برای ایجاد MB-1 در انسان و خرگوش نیز متابولیزه . و انسان موجود است.

مقادیر متابولیتهای ترشح شده در ادرار گونه های مختلف متفاوت است. در خرگوش متابولیت اصلی مکونین بود که از شکسته شدن پیوند C1-9 بدست آمد. در موش صحرایی متابولیت اصلی MA-2 . شکسته شدن C1-9 و O- دمتیلاسیون به خصوص در یک نمونه دیده می شد. در خرگوش و انسان O- دمتیلاسیون اصلی روی بخش فتالید روی می دهد تا MB-2 ایجاد شود. اما در موش صحرایی O- دمتیلاسیون روی هردو بخش فتالید و تتراهیدرو ایزوکینولین انجام می شود تا MB-4 تولید شود (۲۷و۳۷).

۴-۴- مطالعه متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان

عدم مشاهده متابولیت در عصاره سلولی ما را بر آن داشت تا متابولیتها را در ادرار فردی که دارو خورده بود جستجو کنیم. متابولیتها در ادرار نیز شناسایی نشدند. نوسکاپین نیز در ادرار دیده نشد. برای اطمینان بیشتر یکبار هم نوسکاپین و مکونین در ادرار Spike شدند و به HPLC تزریق شدند پیک هر دو ماده به دست آمد. این نشان می دهد که به طور . آن وارد ادرار می شوند. از آنجایی که با روش فوق استانداردهای دارو و متابولیت قابل شناسایی است به نظر می رسد که میزان متابولیت حاصل در حدی است که روش HPLC بدست آمده امکان اندازه گیری آن را ندارد و شاید تغییر حساسیت سیستم به اندازه گیری آن کمک کند.

 

 

 

Abstract

Information about pathways of drug metabolism has important role on understanding of the drug toxicity. These informations can be used in design of new drugs and making clear understanding of carcinogenesis of chemical compositions. So that finding of suitable method in study of drug .been found as the major product of its metabolism. In this study noscapine metabolism was investigated by an ex vivo method, isolated hepatocyte. This method has several outstanding aspects, it is a suitable intermediate between pervious methods such as solubilized enzymes, isolated organelle fraction and direct study on whole animals. These cells have the essential properties of the intact tissue, including similar permeability characteristics, so that they can be used in many biochemical studies.

In this study rat hepatocytes were seprated in accurate process and their viability was confirmed by trypan blue 0.1% test and microscopic evaluation A method was developed for determination of noscapine standard and its major metabolite, meconine by HPLC. Although the standards of noscapine and its major metabolite were observed in spiked solutions but the method was not able to detect the metabolite in cell extract. It seems that the improvement in sensitivity of the detection method helps to observe the parent drug and metabolite simultaneously.[/tab][tab title=”منابع ” icon=”fa-pencil-square-o”] 

 

  1. Katzung, B.G. Basic and Clinical Pharmacology. (2004) 9th edition P: 51-64, 512-528.

 

  1. Dewick, P.M., Medical Natural Products A Biosynthetic Approach. (2003) 2nd edition P: 329-331.

 

 

  1. Evans, W.C. Trease and Evans, Pharmacognosy. (2002) 15th edition P: 357-358.

 

  1. Cone, E.J.; Gorodetzky, C.W.; Shu Yuan Yeh; Darwin, W.D. and Buchwald, W.F. Determination and measurement of opium alkaloids and metabolites in urine of opium eaters by methane chemical ionization mass fragmentography. of chromatography. (1982) 230: 57-67.

 

  1. متابولیسم داروها و مواد شیمیایی (بیوشیمی ترکیبات خارجی)؛ تألیف پارک د.و.، ترجمه آیینه چی ی. و محمودیان م.؛ ۱۳۶۰؛ ص ۸-۱۱٫

 

  1. Hasler, J.A. Pharmacogenetics of cytochromes P450. Mol Aspects Med. (1999) 20(1-2): 12-24, 25-137.

 

  1. Hasler, J.A.; Estabrook, R.; Murray, M.; Pikuleva, I.; Waterman, M.; Capdevila, J.; Holla, V.; Helvig, C.; Falck, J. R.; Farrell, G.; Kaminsky, L.S.; Spivack, S.D.; Boitier, E. and Beaune, P. Human cytochromes P450. Mol Aspects Med. (1999) 20: 1-137.

 

 

  1. Gondfriand, T.; Miller, R. and Wibo, M. Calcium antagonism and calcium entry blockade. Rev. (1989) 38: 321-416.

 

  1. Smith, D.A.; Abel, S.M.; Hyland, R. and Jones, B.C. Human cytochrome P450, electivity and measurement in vivo. (1998) 28(12): 1095-1128.

 

  1. مطالعه فارماکوکینتیک مبودیپین و دیبودیپین، دو مسدد جدید کانال کلسیم، در حیوانات آزمایشگاهی؛ بهلولی ش. پایان نامه شماره ۱۲ گروه فارماکولوژی، دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایران؛ ۸۳-۱۳۸۲؛ ص ۲۷٫

 

  1. Moldeus, P.; Hogberg, J. and Orrenius, S. Isolation and use of Liver cells. Methods Enzymol. (1978) 52: 60-71.

 

  1. Howard, R.B.; Christensen, A.K.; Gibbs, F.A. and Pesch, A.
    J. Cell Biol. (1967) 35:675.

 

 

  1. Berry, M.N. and Friend, D.S. Cell Biol. (1969) 43:506.

 

  1. Wagle, S.R. and Ingebretsen, W.R., Jr, this series 35:579.

 

 

  1. Seglen, P.O. Exp. Cell Res. (1973) 82:391.

 

  1. Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique. (2000) 4th edition P: 96-98, 357-358.

 

  1. روشهای بنیادی کشت یاخته های جانوری؛ خوانساری ن. و شمشیری م.؛ ۱۳۷۴؛ص ۱-۳۰٫

 

  1. Haikala, V. New sensitive method to determine noscapine in serum by reversed-phase liquid chromatography.
    of Chromatography. (1985) 337: 429-433.

 

 

  1. Jensen, K.M. Determination of noscapine in serum by high-performance liquid chromatography. of chromatography (1983) 274: 381-387.

 

  1. کروماتوگرافی و طیف سنجی؛ شفیعی ع.؛ ۱۳۷۳؛ ص ۱-۷۹٫

 

  1. Hamilton, R.J. and Sewell, P.A. Introduction to High Performance Liquid Chromatography. (1981) 2nd edition P: 1-13, 60-78.

 

 

  1. Ravindranath, B. Principles and Parctice of Chromatography. (1989) P: 23-53, 321-332.

 

  1. Schwedt, G. Essential Guide to Analytical Chemistry. (1998) P: 142-147.

 

 

  1. Willette, R.E. Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry. (1998) 10th edition P: 687-711.

 

  1. Karlsson, M.O.; Dahlstrom, B.; Echernas, S.-A.; Johansson, M. and Tufvesson, A. Pharmacokinetics of oral noscapine.
      J. Clin. Pharmacol. (1990) 39: 275-279.

 

 

  1. Dahlstrom, B.; Mellstrand, T.; Lofdahl, C.-G. and Johansson, M. Pharmakokinetic properties of noscapine. J. clin. Pharmacol. (1982) 22: 535-539.

 

  1. Tsunoda, N. and Yoshimura, H. Metabolic fate of noscapine. II. Isolation and identification of novel metabolites produced by C-C bond cleavage. Xenobiotica (1979) 9(3): 181-187.

 

 

  1. Mitchell, I.D.; Carlton, J.B.; Chan, M.Y.; Robinson, A. and underland, J. Noscapine-induced polyploidy in vitro. (1991) 6(6): 479-486.

 

  1. Kamikawa, Y. and Shimo, Y. Inhibitory effects of non-narcotic antitussive drugs on cholinergically and non-cholinergically mediated neurogenic contractions of guinea-pig isolated bronchial muscle. Pharm. Pharmacol. (1991) 43(4): 242-246.

 

 

  1. Mahmoudian, M. and Mojaverian, N. Effect of noscapine the antitussive opioid alkaloid on bradykinin-induced smooth muscle contraction in the isolated ileum of the guinea-pig.

 

  1. Francel, P.C. Bradykinin and neuronal injury. Neurotrauma. (1992) 9 suppl. 1: 527-54. Review.
  2. Ebrahimi A.; Zareie, M.R.; Rostami, P. and Mahmoudian M. Interaction of noscapine with the bradykinin mediation of the cough response. Acta Physiol. Hung. (2003) 90(2): 147-155.

 

  1. Zhou, J.; Gupta, K.; Aggawal, S.; Aneja, R.; Chandra, R.; Panda, D and Joshi, H.C. Brominated derivatives of noscapine are potent microtubule-interfering agents that perturb mitosis and inhibit cell proliferation. Pharmacol. (2003) 63(4): 799-807.

 

 

  1. Zhou, J.; Gupta, K.; Yao, J.; Ye, K.; Panda, D.; Ginnakakaou, P. and Joshi, H.C. Paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells undergo C-Jun NH2-terminal kinase-mediated apoptosis in response to noscapine. Biol. Chem (2002) 277(42): 39777-39785.

 

  1. Joshi, H.C. and Zhou, J. Noscapine and analogoues as potential chemotherapeutic agents. Drug New Perspect. (2000) 13(9): 543-546.

 

 

  1. Ke, Y.; Ye, K.; Grossnikaus, H.E.; Archer D.R.; Joshi, H.C. and Kapp, J.A. Noscapine inhibits tumor growth with little toxicity to normal tissues or inhibition of immune responses. Cancer-Immunol-Immunother. (2000) 49(4-5): 217-225.

 

  1. Tsunoda, N. and Yoshimura, H. Metabolic fate of noscapine. III. Further studies on identification and determination of the metabolites. Xenbiotica (1981) 11(1): 23-32.

 

 

  1. Tsai, C.; Perng, R.; Chang, K.; Venzo, D. and Gazdar, A. Evaluation of the relative cytoxic effects of anticancer agents in serum-Supplemented Versus Serum-free media using a tetrazolium colorimetric assay. J. Cancer (1996) 87: 91-97.

 

  1. Ian freshney, R. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (1992) 2nd edition P: 15-46.

 

 

  1. Chollet, D.F.; Ruols, C. and Arnera, V. Determination of noscapine in human plasma using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography. of chromatography B (1997) 701: 81-85.

 

  1. Lee, D.U. (-)–Narcotine: A facile synthesis and degradation with ethyl chloroformate. Korean Chem. (2002) 23(11): 1548-1552.

 

 

  1. Yin, C.; Tang, C. and Wu, X. HPLC determination of aminophylline, methoxy phenamine hydrochloride, noscapine and chlorphenamine maleate in compound dosage forms with an aqueous-organic mobile phase. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2003) 33: 39-43.

 

  1. Musshoff, F.; Trafkowski, J. and Madea, B. Validated assay for the determination of markers of illicit heroin in urine samples for the control of patients in a heroin prescription program. of chromatography B (2004) 811: 47-52.

 

 

  1. Johansson, M.; Tufvesson, A.; Forsmo-Bruce, H.; Jacobsso, S. and Westerlund, D. Determination of noscapine and its metabolites in plasma by coupled-column liquid chromatography. of chromatography (1988) 459: 301-311.

 

  1. Kikura-Hanajir, R.; Kaniwa, N.; Ishibashi, M.; Makino, Y. and Kojima, S. Liquid chromatographic-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric analysis of opiates and metabolites in rat urine ofter inhalation of opium. of chromatography B (2003) 789: 139-150.

 

[/tab][/tabgroup]

خرید و دانلود فوری

نسخه کامل و آماده
3900 تومانبرای دریافت نسخه کامل

93 صفحه فارسی

فونت استاندارد/B Lotus/14

فرمت فایل WORDوPDF

دارای ضمانت بازگشت وجه

نسخه قابل ویرایش+نسخه آماده چاپ

دریافت فوری + ارسال به ایمیل

[well boxbgcolor=”#e5e5e5″ class=”fontawesome-section”][tblock title=”برای مشاهده تمام پروژه ها ، تحقیق ها و پایان نامه های مربوط به رشته ی خود روی آن کلیک کنید.”][/well]

(برای امنیت و سهولت بیشتر پیشنهاد میشود با نرم افزارهای موزیلا فایر فاکس و یا گوگل کروم وارد شوید)

***************************

*************************************

پرداخت از درگاه امن شاپرک  با همکاری شرکت زرین پال صورت میگیرد

 ۱۵ درصد از درآمد فروش این فایل به کودکان سرطانی(موسسه خیریه کمک به کودکان سرطانی) اهدا میشود

پس از پرداخت،علاوه بر ارسال فوری فایل ها به ایمیلتان،مستقیماً به صورت اتوماتیک به لینک دانلود فایل ها  ارجاع داده میشوید.

در صورت نیاز به هرگونه راهنمایی با ایمیل (MASTER@NEXAVARE.COM) یا شماره تماس پشتیبان (۰۹۳۶۹۲۵۴۳۲۹) در ارتباط باشید

[alert type=”alert-danger”]کاربر گرامی، برای تهیه این اثر هزینه و زمان زیادی صرف شده است.که اکنون با این قیمت ناچیز در اختیار شما قرار گرفته است.لطفاً  تنها جهت استفاده دانشجویی یا شخصی خرید نمایید.همچنین اگر مدیر یک وبسایت یا وبلاگ هستید خواهش میکنیم آن را کپی نکنید.و یا در صورت کپی منبع را به صورت لینک درج نمایید. ضمناً شرعاً هم لازم به کسب رضایت است که به علت زحمت زیاد در انتشار ، کارشناسان ما رضایت استفاده بدون پرداخت هزینه آن را ندارند.تشکر از حمایت شما[/alert]


درباره نویسنده

publisher4 222 نوشته در سیستم همکاری در خرید و فروش فایل نگزاوار دارد . مشاهده تمام نوشته های

مطالب مرتبط


دیدگاه ها


دیدگاه‌ها بسته شده‌اند.